CXCR4启动子调控的条件复制型腺病毒抗前列腺癌细胞的实验的研究.pdf

摘要 摘要 前列腺癌是西方国家常见的恶性肿瘤，我国前列腺癌的发病率虽比西方国 家低，但随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变，近年来前列腺癌发病率 呈不断上升趋势，成为影响我国老年男性生活质量及预期寿命的重大疾病。在 前列腺癌治疗中，尽管大部分前列腺癌在早期治疗中疗效显著，但是部分表现 出较强的侵袭性、易复发甚至出现转移，内分泌治疗晚期几乎都出现激素抵抗， 治疗这些前列腺癌使用现有的治疗方式往往会显得捉襟见肘。近年来，随着分 子生物学研究的进展，基因治疗逐渐成为肿瘤学研究的热点，呈现出良好的应 用前景。如何使得基因治疗对肿瘤的选择性强，对正常细胞干扰小，对晚期肿 瘤或转移瘤灶仍有效等理念，越来越受到人们的重视。 目前，具有在特定肿瘤细胞中条件性增殖复制并最终裂解肿瘤细胞的条件 型溶瘤腺病毒，引起了人们极大关注，溶瘤病毒用于肿瘤治疗的研究发展非常 迅速。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制导致细胞溶解和死亡，而且通过受 感染的细胞释放出更多的病毒颗粒，产生一种级联放大效应，直至肿瘤细胞被 清除。目前已可利用基因工程手段使溶瘤效应更加具有特异性和条件性，溶瘤 腺病毒可以针对不同肿瘤加载其肿瘤特异性启动子，使得溶瘤病毒仅在特异的 肿瘤组织中保持高活性，发挥溶解肿瘤细胞的功效。趋化因子受体CXCR4是近 年来肿瘤研究领域中的热点，趋化因子受体CXCR4属于趋化因子受体家族，是 一个具有352个氨基酸且高度保守受体蛋白，为七次跨膜的G蛋白偶联膜受体， 已被证实在多种肿瘤细胞中高度特异性表达。目前，已有研究证实CXCR4启动 子在。肾癌和神经胶质瘤中呈现肿瘤特异性，这提示CXCR4启动子极有可能成为 前列腺癌基因治疗中肿瘤特异性启动子的候选者。 因此，本研究重点评价并比较CXCR4启动子调控的条件复制性腺病毒 Ad．CXCR4．E1对前列腺癌细胞生长抑制的情况，分为如下部分： 第一部分CXCR4在前列腺癌细胞与前列腺上皮细胞中的表达差异 上皮细胞RWPE—l中的表达，探讨趋化因子受体CXCR4在癌细胞和正常细胞系 II 摘要 的表达差异。 方法：常规培养前列腺癌细胞LNCaP、PC．3、前列腺上皮细胞RWPE．1， 水平上韵表达情况，Western 细胞中转录后水平的表达情况。 结果：三种细胞中都可以检测到CXCR4的表达，但在前列腺癌细胞中， 达水平为LNCaPPC．3(P0．05)。 结论：通过三种细胞系的比较，前列腺癌细胞LNCaP及PC．3中存在CXCR4 高表达，提示前列腺癌细胞中存在CXCR4特异性高表达。 第二部分CXCR4启动子的克隆及其在前列腺癌细胞中转录特异性 分析 目的：评估CXCR4启动子在前列腺癌细胞中的特异转录活性。 方法：采用PCR方法扩增CXCR4启动子序列，将其克隆到含有报告基因 种细胞中的荧光素酶活性。 结果：CXCR4启动子仅在前列腺癌细胞中表现出特异的转录活性，其中 不到DsRed2的表达。荧光素酶活性表明CXCR4启动子在前列腺癌细胞中的活 性远高于前列腺上皮细胞(PO．001)。 结论：CXCR4启动子在前列腺癌细胞中具有较强的特异转录活性，提示 CXCR4启动子可以作为前列腺癌基因靶向治疗的“特异开关”。 第三部分CXCR4调控的条件复制型腺病毒对人前列腺癌细胞特异 性杀伤作用 摘要 细胞LNCaP，PC．3及人正常前列腺上皮细胞RWPE．1，通过检测细胞存活率评 价条件复制性腺病毒对于前列腺癌细胞的特异性杀伤。 病毒必需的El区基因，构建含有CXCR4启动子的条件复制型腺病毒 RWPE．1。Western blot检测感染后细胞E1蛋白的表达。感染后行细胞病变试验、 台盼蓝染色、MTT、结晶紫染色法及流式细胞学检测，评估重组腺病毒对前列 腺癌细胞生长及杀伤的影响。 结果：质粒酶切鉴定及PCR结果证实成功构建了含有CXCR4启动子和E1 区基因的条件复制型腺病毒载体Ad．CXCR4．E1，WeStemblm结果显示感染 常前列腺上皮