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Dvl 调控间充质干细胞向 HGF 的定向迁移 中文摘要 中文摘要 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs ）是一种间质组织细胞，可以从 不同的组织中分离得到如骨髓、骨骼肌、脂肪、脐带、循环系统、牙髓和羊水等， 具有自我更新和多向分化的潜能，可诱导分化成骨、软骨、肌、脂肪和神经等多 种细胞，在大鼠脑缺血区域或脊髓损伤区域移植 MSCs 能够促进其向损伤部位迁 移并行使其修复功能。为了保证移植的 MSCs 由移植部位迁移到受损部位，且要 保证迁移到损伤部位的细胞数量，这就需要研究调控细胞定向迁移的分子机制。 研究发现HGF 能够通过结合其受体c-met 使 β-catenin 入核，从而激活Wnt/β-catenin 信号通路促进细胞的迁移。而 Dvl 作为该信号通路的关键蛋白，参与调节 HGF 所 诱导的肿瘤细胞的侵袭，本实验旨在研究 Dvl 对 HGF 诱导的MSCs 定向迁移的作 用机制。 采用全骨髓法从SD大鼠骨髓中成功分离并在体外培养出高纯度的MSCs 。用P3 代以上细胞作为实验材料，提取MSCs 的总RNA ，RT-PCR克隆得到SD大鼠的Dvl 以及其结构缺失突变体ΔDIX和ΔDEP 的cDNA，利用AdEasyTM系统构建重组腺病毒 载体Ad-Dvl、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP 。构建成功的重组腺病毒在QBI-293A细胞中包 装以及扩增，获得高滴度的病毒子，感染细胞以获得高表达Dvl 、DIX和DEP 的 MSCs 。同时针对SD大鼠Dvl基因由Abgent 公司设计并合成FAM荧光标记的siRNA： FAM-siRNA，用脂质体转染MSCs 降低Dvl 的表达。为进一步检测Dvl在MSCs 的定 向迁移过程中的作用提供有利的工具。 首先研究 Wnt/β-catenin 信号通路对 MSCs 迁移行为的影响。通过使用抑制剂 DKK1 和 FH535 以及激活剂 LiCl 和 Wnt3a 改变 Wnt/β-catenin 信号通路，采用 Boyden chamber 与 Dunn chamber 装置研究表明激活剂 LiCl 和 Wnt3a 促进了MSCs 迁移，而抑制剂 FH535 降低MSCs 的迁移能力，并能够阻遏 Wnt3a 和 LiCl 对细胞 迁移的促进作用。Western bolt 表明 Wnt3a 和 LiCl 促进 β-catenin 的累积，而FH535 能够抑制这一效应，说明激活的 Wnt/β-catenin 信号通路能够通过上调 β-catenin 调 控 MSCs 迁移，但却发现抑制剂 DKK1 促进了 MSCs 的迁移，并略微增强 Wnt3a 促进的细胞迁移能力。据报道 DKK1 通过 JNK 调节细胞迁移，故此利用 JNK 的特 I 中文摘要 Dvl 调控间充质干细胞向HGF 的定向迁移 异性抑制剂 SP600125 处理细胞，结果显示 SP600125 抑制 DKK1 对 MSCs 迁移的 促进作用，同时发现DKK1 能够增加 JNK 的磷酸化，这说明 DKK1 可能通过 JNK 介导的非经典Wnt 信号通路调节 MSCs 的迁移。 为了证明 Dvl 在 MSCs 的定向迁移过程中的作用，利用实时荧光定量 PCR 从 mRNA 水平检测 MSCs 中 Dvl 三种亚型的相对表达情况，数据显示 MSCs 中 Dvl 的三种亚型均表达，但是相对表达量不同，Dvl2 表达量最高，Dvl1 和 Dvl3 的表 达量相对较低，仅仅占总 Dvl 表达量的 10%。用Wnt3a 、DKK1 以及HGF 处理后， Dvl 三个亚型在 mRNA 水平上有较小的变化，这说明 Wnt3a 、DKK1 以及HGF 调 节 Dvl 并不是在 mRNA 水平发挥作用的，可能是在蛋白水平或 Dvl 在胞内不同分 布来发挥其生物学功能。 最后利用 siRNA 降低MSCs 中Dvl 的表达以及Ad-Dvl 感染 MSCs 高表达Dvl， 通过改变 MSCs 中Dvl 的水平，利用 Dunn chamber 和 B