N乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ表达受阻引起细胞ER stress研究.pdf

N．乙酰氨基葡萄糖转移酶V表达受阻引起细胞ER stress的研究 中文摘要 N．乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)是存在于高尔基体中的N糖链外链 man)形成Bl，6键，是合成c2C2，6型三天线和C2，4C2，6型四天线N糖链 所必需的，细胞表面B1,6分支结构的多少主要取决于GnT-V活性及表达的 高低。大量研究表明肿瘤细胞侵袭很大程度上是由于细胞表面形成过量的N 糖链B 1,6分支结构导致生成多天线的N糖链结 1,6分支结构所致，过多的13 构改变了糖蛋白分子的生物学性状，使肿瘤细胞粘附功能发生异常而易发生 向周围组织侵袭。本教研室以往的研究发现用反义核酸技术阻断体外培养 例如生长缓慢，对血清饥饿耐受下降，对凋亡诱导剂全反式维甲酸(ATRA) GnT-V-AS／HH7721细胞基因表达谱具有内质网应激(ERstress)的特征。ER stress是由于内质网内未折叠蛋白堆积到一定程度引起的一种真核细胞应激 stress 现象，是近年来新发现的重要的凋亡起始机制之一，目前国外对ER 的研究报导较多，国内尚未见研究成果报导。本文以H7721细胞为材料从分 stress的现象进行了较为系统的研究并 子水平对GnT-V表达受阻后引起ER 探讨其产生机制。 一．Gn’r-v-As小7721和H7721细胞基因转录水平表达情况的总体比较 的表达进行检测和比较，结果表明GnT-V-AS／H7721细胞基因转录水平具有 以下特点：(1)介导内质网中蛋白折叠的伴侣蛋白如BIP、蛋白质二硫键异构 酶、脯氨酰肽酰异构酶D和A以及一些热休克蛋白表达上调为H7721细胞 的3倍以上，其中BIP更上调为8．21倍， (2)蛋白质合成系统的一些基因表 表达仅为H7721细胞的O．1l—O．45，(3)涉及泛肽和蛋白酶体的蛋白降解途径 的基因表达上调，如泛肽水解酶，E2．泛肽结合酶，蛋白酶体亚基 明这些现象符合近年来才发现的，普遍存在于真核细胞中的ERstress现象， 因此推测GnT-V表达受阻可能是GnT-V-AS／H7721细胞产生ERstress的起始 原因。 GnT-V-AS／H7721和H7721细胞ERstress过程中的关键信息分子的检测 比较 为验证GnT-V二AS／H7721细胞株存在ERstress现象，本文以 H7721细胞作为阴性和阳性对照，检测ERstress过程中的关键分子的表达。 ER BIP是ER stress信号传导过程中最终上调的靶目标，其表达上调是公认的细 胞发生ER stress标志。转录因子XBPl是哺乳动物细胞ERstress信号传导 过程中的中枢性调节分子，细胞发生ERstress时其mRNA发生特异性地剪 接。PERK是位于内质网的elF2a蛋白激酶家族成员，细胞发生ERstress时 特异性地发生活化，并通过磷酸化翻译起始因子elF2ct而下调细胞蛋白合成 水平。对这三种ERstress关键分子的检测发现：和阴性细胞相比较，实验细 胞中BIP的表达无论是蛋白水平还是转录水平都有明显的上调，但上调程度 都要低于DTT处理的ERstress阳性细胞；XBP．1mRNA在实验细胞中部分 被剪接，在阳性细胞中XBP．1mRNA完全被剪接，而在阴性细胞中其以非 stress阳性细胞相似，实验细胞中的 剪接形态存在；此外和DTT处理的ER PERK发生磷酸化，表明ERstress过程中通过磷酸化eIF2n抑制蛋白合成机 制的活化，这和芯片所检测到的GnT-V-AS／H7721细胞蛋白合成系统水平下 stress现象，并 调相一致。这些结果表明GnT-V-AS／H7721细胞中存在有ER stre