副溶血弧菌分子检测靶点筛选及其内标PCR体系建立.pdfVIP

Dissertation submitted for requirement of Master ’s degree IDENTIFICATION OF NEW TARGETS AND DEVELOPMENT OF A PCR METHOD WITH INTERNAL AMPLIFICATION CONTROL FOR THE DETECTION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS Graduate Xiaohua He Supervisor Prof. Xianming Shi Major Food Science Shanghai Jiao Tong University Shanghai, China January 20 10 本研究承蒙 上海市科委项目 (No. 091422021200, 09DZ0503300, 08142200700, 08DZ0504200) 国家科技支撑计划世博科技专项 (No. 2009BAK43B31) 资助 上海交通大学硕士论文 副溶血弧菌分子检测靶点的筛选 及其内标PCR 体系的建立 摘 要 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是引起食源性疾病的一种重 要致病菌，它常污染海产品如蟹、牡蛎、虾、贝等，从而引起食物中毒。 中国国家食源性疾病监控网络数据显示，近年来沿海地区副溶血弧菌感 染事件和人数呈明显上升趋势，甚至超过沙门氏菌跃居首位，因此，建 立快速、灵敏的副溶血弧菌检测方法对于食品安全监控具有重要意义。 以分子生物学为基础发展起来的聚合酶链式反应（PCR ）技术，凭 借其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优势，在副溶血弧菌的快速检 测中具有广阔的应用前景。但是，目前文献报道的副溶血弧菌检测靶点 不仅数量有限，且特异性不强，易造成假性结果。此外，抑制成分的存 在也会干扰PCR 扩增反应，出现假阴性检测结果。因此，为有效提高PCR 检测方法的准确率，发掘新的检测靶点，并在PCR 反应体系中加入指示 假阴性的扩增内标是非常必要的。本研究致力于发掘新的检测靶点，并 与人工构建的扩增内标相结合，建立水产品等食品中副溶血弧菌新的 PCR 检测体系，研究内容主要包括以下三个方面： 一、副溶血弧菌种特异检测靶点的筛选及其验证 本研究通过在线BLAST 比对以及PCR 评价等方法从61 个候选靶点 中筛选出一个特异强、灵敏度高的检测靶点（vp1332 ），并基于该靶点建 立了两种PCR 检测体系，即添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR 检测 i 上海交通大学硕士论文 体系与添加有扩增内标的荧光定量PCR 检测体系。 二、建立添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR 检测体系 1）扩增内标的构建：在副溶血弧菌基因组中选取一段与目的基因 （vp1332 ）同源性很低的序列，采用复合引物的方法构建扩增内标； 2 ）PCR 反应体系的优化：经过优化后，选择退火温度为58ºC 、Mg2+ 浓度为 1.5 mmoL/mL 以及扩增内标添加量为4.29×10