纳米金标芯片优化及其在前列腺癌临床诊断上的应用的研究.pdf

纳米金标芯片优化及在前列腺癌临床诊断 上的应用研究 专 业：动物学 硕士生：郑志伟 指导教师：常弘教授 摘要 近年来，我国男性前列腺癌发病率呈明显上升趋势，在欧美国家，前列腺癌 己连续多年居男性恶性肿瘤发病率首位，其发病率超过肺癌，死亡率在男性恶性 肿瘤中居第二位。前列腺癌是一个起源于多病灶和随机进展模式的异质性疾病。 到目前为止对晚期和转移性尤其是激素非依赖型、放疗和化疗抵抗型前列腺癌依 然没有治愈的疗法。研究前列腺癌进展相关的基因可能揭示其机制或找出新的治 疗靶标。 基因芯片技术具有高通量、高特异性等特点，在疾病诊断等领域应用前景广 泛，但是目前主要基因芯片技术均存在着检测仪器昂贵或灵敏度较低等问题，从 而限制该技术的进一步发展。 本研究利用纳米金可以与银结合后形成体积为原来106倍的黑色颗粒，并且 可以凭肉眼观察，普通扫描仪读取图像的特点，将纳米金应用于基因芯片检测技 术。首先建立定性检测的纳米金标记芯片技术，并对芯片技术中点样液，预杂交， 纳米金浓度，银染时间等多个条件进行了优化，结果表明，使用50％DMSO作为点 样液效果最好，预杂交会导致杂交信号降低70％，银染时间控制在15min时显 色清晰且背景较低。该检测方法的灵敏度可达到80fmol／L，为建立稳定性，重 复性好的纳米金标芯片技术打下基础。 同时摸索将纳米金标芯片技术用于前列腺癌临床诊断，PCa是多因素、多基 因突变引起的疾病，凭单一指标的检测无法准确判断，故经充分的文献调研，预 KLKl、肛您、TMPRSS2、鳜豳彪)进行检测，对各基因表达进行研究。本研究首 次将纳米金标芯片用于基因表达研究，为更好的达到实验目的，首先使用目前已 经成熟并且成本较低的辣根过氧化物酶标记法摸索建立了探针设计，芯片制备， 样本标记，至杂交反应的前期实验条件。研究发现： (1)寡核苷酸探针浓度达到100|lM时，各检测点信号最强。 u uM (2)进行样本标记过程中，采用biotin-16-dUTP为40M，而dTTP为40 的反转录体系。 (3)使用辣根过氧化物酶芯片标记法对PC3和DUl45两种细胞株的11个前 列腺癌特异靶标进行检测，发现两种标本中各基因表达差异不明显，这为使用纳 米金标芯片检测提供了一个依据。 在前期研究基础之上，杂交后改用纳米金进行标记，并对纳米金浓度进行了 探针点呈现明显的显色点，阴性对照无显色，符合实验要求，但是在定量方面暂 时还不满足实验要求。 本研究首次将纳米金标记芯片用于基因表达研究，成功使用该芯片完成定性 检测，并建立了从探针设计，芯片制备，样本标记到杂交过程的芯片实验，为进 一步对基因表达进行定量研究打下了基础，该技术方法的建立也将为临床诊断与 治疗提供新的途径和可能。 关键词：前列腺癌，纳米金，基因芯片，基因表达 Ⅱ of and on Optimization nanogoldmicroarraystudy the ofProstatecancer diagnosis Major：Zoology Name： Zhiwei Zheng Supervisor：Prof．ChangHong Abstract The incidence cancerhasbeen inrecent inChinese