采用RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体表达的实验的研究.pdfVIP

中文摘要 第一部分 采用RNA干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白的表达 目的：本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学台成双链RNA 技术开展基因治疗提供实验依据。 reagent， Lipofectamine 强度的变化，观察不同阳离子脂质体的体外转染效率。(3)采用dsRNA— Lipofectamine 0 u 02，0．04，0．08，0．16mol／L)转染细胞48h以观察剂量效应关系。dsRNA 0．08 8 u ul转染细胞，于4个不同的时间点(12h，24 mOl／l。／Lipofectamine2000 h，48h，72h)观察时间效应关系。 强，转染48 显著，TransIT—TKO组，01igofectamine 性较强。结果还表明dsRNA／Lipofectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及 2000 H寸删双重依赖性，dsRNA0．08u 8u]／6孔培养板转 mol／L／Lipofectamine 染细胞48h的抑制效应最强。 结论：(1)体外化学合成的dsRNA可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基 2000的转染效率 因沉默效应。(2)三种不同的阳离子脂质体中Lipofectamine 最强，且细胞毒性轻微。(3)dsRNA／Lipofectamine2000诱导的RNAi效应具 有剂量及时间双重依赖性。 关键词：RNA干扰；双链RNA：绿色荧光蛋白 第二部分RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体的表达 期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据。 2000结合后转染细胞，采用荧光显微镜、Westernblot技术和流式细胞仪检测 Jne Lipofectam 期，采用ELISA法测定配体EGF含量，结合细胞计数、集落形成、刮痕实验、化 A1细胞生物学特性的改变。 疗敏感·li3)析观察抑制EGFR表达后，A549、SPC 2000 复合物转染细胞可引发EGFR序列特异性基因沉默效应，荧光显微镜下观察、流 Blot分析得到了一致的结果。对于A549细胞，与对照 式细胞仪检测、Western 生【丈抑制了85，O％，集落形成抑制了63．3％，细胞迁移能力明显降低。细胞周期 dsRNA 了78．3％，集落形成抑制了66．8％，细胞迁移能力明显降低。细胞周期分析结果 的EGF分别降低了45．65％、22．45％。 EGFR表达可湿转抑制细胞增生和细胞迁移，降低配体EGF的含量，将更多的细 从而为NSCLC基因治疗提供了新策略。 关键词：表皮生睦因子受体；RNA干扰：小干扰RNA；双链RNA；非小细胞肺癌 第三部分RNA干扰技术抑制NSCLC细胞EGFR表达的在体实验研究 据。 规动物接种，测量肿瘤体积和动物重量，计算肿瘤抑制率。(3)接种27d后处死 裸鼠，采用免疫组化和WesternBlot技术测定肿瘤组织的EGFR蛋白水平，采用 Rea卜L EGF含量。 dsRNA。EGFR组裸鼠的体重依次为26．844-1．08g、23．524-0．94g、23．504-1．32g、 Westem 谰21．05％。 基因序列设计的siRNA可作为极具开发前途的抗肿瘤新药，其在体实验中触发 RNAi可能的作用机制尚需进一步深入探讨。 关键词：RNA干扰；NSCLC；EGFR；小干扰RNA；成瘤率；肿瘤抑制率 ABSTRACT Part