高效液相色谱-柱后同位素稀释质谱法定量分析人血清中转铁蛋白及白蛋白.pdfVIP

第 42卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第2期 2014年2月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 179—185 DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．30906 高效液相色谱-柱后同位素稀释质谱法 定量分析人血清 中转铁蛋 白及 白蛋 白 张 丹 冯流星 王 军 熊金平 (北京化工大学，材料科学与工程学院，北京 100029) (中国计量科学研究院，北京 100013) 摘 要 建立了高效液相色谱 (HPLC)与电感耦合等离子体质谱 (ICP—MS)联用，同时结合柱后 同位素稀释 法 ，通过直接测定硫及铁元素，实现蛋白质绝对定量的分析方法。选取分子量不同的4种标准蛋白：转铁蛋 白、8乳球蛋 白、肌红蛋白和溶菌酶作为混合蛋白 34S或”Fe同位素稀释剂与液相色谱洗脱液经三通混合后， 在线进入 ICP—MS检测。根据同位素稀释法公式及蛋 白中硫、铁的含量计算混合蛋白中每种蛋白的浓度，与 天平称量结果一致 ，对方法进行了验证。将方法应用到人血清转铁蛋 白、白蛋 白的定量分析，针对两种蛋 白含 量差别大导致的信号差异，通过改变同位素稀释剂的流速，成功测定了人血清中转铁蛋白、白蛋白的含量。采 用”S及”Fe同位素稀释剂分别定量的血清中转铁蛋白浓度为 (2．35±0．01)g／L和 (2．22~0．13)g／L，结果基 本吻合。方法精密度RSD均小于 10％，可用于基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的定量分析。 关键词 同位素稀释；蛋白质定量；电感耦合等离子体质谱；转铁蛋白；白蛋白 1 引 言 蛋 白质组学的快速发展，不但需要准确鉴定蛋 白质，还要求对处于动态变化的蛋 白质进行定量分 析 ¨ J。目前比较成熟的定量方法多是基于稳定同位素标记的生物质谱 ，oJ，但是生物质谱的信号响 应与蛋 白质或肽段含量间的关系十分复杂，没有蛋 白质标准作归一化处理，很难对蛋 白质或肽段定量。 与生物质谱不同，电感耦合等离子体质谱 (ICP—MS)分析中元素的响应与原子所处的分子环境无关 ， 而且样品处理简单，易于色谱联用，可进行同位素分析 j。因此，利用 ICP．MS对蛋 白质中的元素定量 分析，是近年来蛋白质定量技术研究的热点。硫是最适合作为蛋白质定量分析的元素 j。根据Swis— sProt蛋 白质数据库的统计分析，分别有96．6％、98．8％的蛋 白质含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基 酸_l。J。如果蛋 白质的氨基酸序列已知，就能确定其中的硫原子数；那么通过 ICP—MS测定硫的含量来实 现蛋白质的定量是完全可行的¨。但是，目前 ICP。MS直接测定硫来定量的蛋白，主要是标准蛋 白，涉及 基体样品的很少，因为ICP—MS测量硫存在一些困难：需使用碰撞池技术或高分辨 ICP—MS克服 O；对硫的 谱线干扰 ¨。常见的ICP．MS对蛋 白质定量研究集中在金属蛋 白上 ¨ J，定量原理与含硫蛋 白相同。 为保证定量分析的准确度，需使用与待测蛋 白匹配的标准物质来保障质控与量传，但 由于蛋 白质种 类繁多、结构复杂，目前可获得的蛋 白标准十分匮乏。同位素稀释法(ID)是国际公认的具有权威性化 学计量方法，只需硫或金属的浓缩同位素即可实现不同基体蛋白的定量分析_l。 高效液相色谱 (HPLC)的同位素稀释法分为特异性、非特异性形态_1。前者在前处理时就将稀释 剂加入到样品中，具有传统同位素稀释法的优点；但是必须开发针对 目标蛋 白的特异性稀释剂制备方 法，目前商品化或人工合成的稀释剂非常有限，直到2005年才有文献报道第一次应用到蛋白质的定量 分析 。而非特异性形态同位素稀释(也称柱后同位素稀释)对蛋 白质的种类、结构没有要求 ，同位素 稀释剂常为某元素的简单离子，基本都有商品化的产品，适合于蛋 白质的定量分析。 目前，文献报道了高效液相色谱．柱后同位素稀释质谱法 (HPLC—ID—ICP—MS)，通过测硫定量标准蛋 白¨和测铁定量转铁蛋白14]，但是未见对硫、铁共同定量蛋白的比较及人血清中多种蛋白的定量