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基 因 工 程 §1、DNA重组技术的基本工具 §2、基因工程的基本操作程序 § 3 基因工程的应用 §1、DNA重组技术的基本工具 1、基本工具有三种： 限制酶、DNA连接酶、载体 2、限制酶所识别的序列有什么特点 ？ 中轴线两侧的双链DNA上碱基是反向对称重复排列的 3 、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较： （2）不同点：DNA连接酶是在 _______之间形成磷酸二酯键，______(需/不需)模板；DNA聚合酶只能将___________加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键, ______(需/不需)模板。 4、与磷酸二酯键有关的酶有哪些？ DNA聚合酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 双链DNA片段 磷酸二酯 不需 单个核苷酸 需 （1）相同点：都在形成__________键的过程中起催化作用。 例题1 黏性末端 黏性末端 2、不同的限制酶切割ＤＮＡ时，可能切出相同的黏性末端吗？ 1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 可能 １、限制酶作用于____________键 磷酸二酯 例题3 作用部位：_________ 键 2、 DNA连接酶——“分子缝合针” 磷酸二酯 返回 例1、下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，依次表示何种酶的作用。 A____________,B______________,C__________,D__________ 限制酶 DNA连接酶 解旋酶 DNA聚合酶 天然质粒能否直接作为载体？为什么？ 不能，因为作为载体必须满足以下条件： 1、必需具有一个或多个限制酶的切点 2、必需具备自我复制的能力或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 3、必需带有标记基因 4、载体DNA必需是安全的 5、载体DNA分子大小应适合 实际上天然质粒并不完全具备上述条件，都要经过人工改造后才能用于基因工程操作。 1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定 §2、基因工程的基本操作程序 四个基本步骤： 下页 2、构建基因组文库需要哪些酶？ 限制酶、DNA连接酶 构建cDNA文库需要哪些酶？ 逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 PCR技术 DNA复制 相 同 点 原理 碱基互补配对 原料 4种脱氧核苷酸 条件 模板、ATP、酶 不 同 点 解旋方式 场所 酶 结果 形成大量的DNA片段 形成整个DNA 高温下变性解旋 解旋酶催化 生物体外 主要在细胞核内 Taq 酶 解旋酶、DNA聚合酶 3、PCR技术与DNA复制的比较： 1、目的基因的获取方法有：_______________________、______________________、__________________________、___________________________ 从基因组文库中获取 从cDNA文库中获取 利用RCR技术扩增 人工合成法 载体（质粒） 限制酶切割 载体被切开 露出黏性末端 DNA被切开 露出黏性末端 DNA连接酶 重组DNA（重组质粒） 基因表达载体构建的过程： 限制酶切割 1、在进行基因表达载体构建时， 需要哪些工具酶？ 使用的限制酶必须是同种吗？ 为什么？ 限制酶、DNA连接酶 不一定，因为不同种限制酶可能切出相同的黏性末端，只要使载体与目的基因露出相同的黏性末端，就能通过DNA连接酶将它们连接起来。 ＤＮＡ（含目的基因） 例题3 3、基因表达载体的组成元件有 ： 启动子、终止子、标记基因、目的基因 2、标记基因的作用是： 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 1、将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？ 其中农杆菌转化法适用于什么类型的植物？（说明：常见的单子叶植物有小麦、水稻，双子叶植物有棉花） 植物的哪些细胞可以作为受体细胞？ 体、受精卵 细胞 双子叶、裸子植物 2、如果受体细胞是动物细胞，一般常用什么类型细胞？为什么？ 受精卵细胞 ，受精卵的全能性最高，能发育成一个新个体。 3、为什么基因工程常采用原核生物作为受体细胞？ 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 4、若要生产人的糖蛋白，可以用原核生物吗？为什么？ 不能，因为在蛋白质上结合糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而原核生物无上述两种细胞器。 农杆菌转化法、基因枪法、 花粉管通道法 已知序列 杂交带 带有 分子检测： 1 2 3 检测目的 目的基因是否整合到DNA上 目的基因是否 转录出mRNA 目的基因是否 翻译成蛋白质 导入检测 表达检测 表达检测 检测工具 检测对象 转基因生物基因组DNA 转基因生物