第2章 凝胶过滤层析.pptVIP

一、一般介绍 三维空间网状结构 ?二、凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。 2.操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。 三、凝胶层析的缺点 四、凝胶的类型 1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。 （2）特点 交联度： 交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松 化学性质： 稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强酸 Sephadex的分级范围 G10 700 G15 1,500 G25 1,000-5,000 G50 1,500-30,000 G75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000 吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml。 大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。 五、【实验器材】 层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿 六、【操作方法】 凝胶的处理 装柱；平衡； 上样； 洗脱和检测； 层析柱的再平衡； 1、凝胶的处理 　　　Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。 2、装柱 关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无“纹路”。 3、平衡 将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。 4、加样与洗脱 将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（ 0.5ml/min）。 5、收集与测定 用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。 6、凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍床体积）即可。 7、凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷 操作过程注意事项 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。 七、其它条件选择 1.柱的选择： 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。 八、应 用 附1：凝胶层析过程的数理关系 1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg） 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。 凝胶暂时不用时，可加少许防腐剂如0.02%叠氮钠或0.002%的洗必泰防止染菌。用过的凝胶可加热灭菌后低温保存或用20%左右的乙醇保存。 2.样品的选择： 量适当, 粘度小。 3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。 1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量 检测蛋白分子量 柱床体积VT 凝胶干体积Vg 内水体积Vi 存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相