小鼠肾发生发育中BCL-2%2fBAX表达.pdfVIP

激活而抑制凋亡瞄。2蜘。凋亡相关蛋白BAX正好相反，BAX主要分布在细胞质中， 凋亡诱导信号可以使BAX的构象改变，并整合于线粒体的外膜，最终导致线粒体 凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率直接决定了线粒体外膜各种通道的开放程度，形成 了细胞凋亡调控的枢纽。 肾脏的细胞凋亡受到外因和内因的调控，生长因子是重要的外源性调节因素， 而BCL-2家族蛋白则是关键的内源性调节因素‘22】。在胚胎肾的发育中，一旦生后 肾原基被输尿管芽诱导，其BCL．2水平即明显上调，使间充质细胞成功向上皮细 动物模型其生后肾原基的间充质细胞将发生恶性凋亡，出生时即表现为肾发育不 全，之后则发育为多囊,肾：[30-31,331。 肾脏在实现其生理功能从低级到高级的长期进化中形成了空间排列精致的微 细结构，其与功能相辅相成是实现肾重要生理功能的保证。在皮髓质中两种。肾小 管存在着种属差异，这种结构的差异，决定了对肾小球滤过液的重吸收，以及尿 液浓缩与稀释等重要肾生理功能的种属差异[34-371。因此，在探索肾生理及病理现 象时，即需要平面结构和立体结构相结合的分析，又需要结构和功能相关联的思 维。 上世纪80年代之前，组织微细结构的三维研究主要采用对连续二维显微图像 的描述。这种传统的组织形态学研究方法工作量繁重又耗时，常常限制了连续切 片的数量，微细结构包含的三维形态信息也必然有限。在大存储量，高运算速度 的计算机，先进显微镜配上高分辨率的CCD数码相机的配合下，对组织微细结构 的三维研究已经发展到数字手段。 本研究采用数字手段三维重建肾微细结构，使小鼠肾发育中小管精确走行的 描述得以实现，并在此基础上对特定时间的肾组织切片采用免疫组化与计算机三 维重建相结合的技术，精确的显示凋亡相关蛋白BCL．2和BAX的表达部位，以 及凋亡细胞的分布，并探讨其对肾脏发育的影响。 实验方法 2 采用适当浓度的强碱溶液蚀刻环氧树脂以提高免疫反应，并应用高温高压以 提高其抗原性，随后检测小鼠肾脏发育过程中增殖与凋亡相关蛋白在树脂切片上 d和P7 的表达。经心脏灌流固定后取E17 d小鼠肾组织块，并树脂812包埋，垂 直肾长轴从肾被膜到肾外髓外带2．519n连续半薄切片，显微镜下获取数字图像， 计算机配准，C语言编程，选取连续切片，树脂切片倒扣再包埋，llun连续切片， 对组织进行BCL．2及BAX免疫组化染色，追踪阳性反应肾小管并三维重建目的 小管的走行。最后应用免疫组化、原位末端标记技术并结合体视学分析方法观察 E16d、E18 d、P3d、P5d、P7d、P14d、P21 d和P1 d小鼠肾脏不同发育时 期BCL．2、BAX及细胞凋亡的演变规律。 实验结果 l、树脂与石蜡切片上增殖与凋亡相关蛋白的表达及原位末端标记 法对凋亡细胞的检测 凋亡相关蛋白BCL．2和BAX在树脂切片与石蜡切片的表达一致，但树脂切 片的组织结构比石蜡切片更完整。增殖相关蛋白K167的阳性表达只出现在石蜡切 片上，在树脂切片上则没有表达。 TUNEL阳性细胞在树脂切片与石蜡切片的表达一致，而且，树脂切片比石蜡 切片展示了更为良好的组织结构。 2、树脂切片上BCL-2和BAX的免疫荧光双标 在树脂切片上也可以显示凋亡相关蛋白BCL．2和BAX的免疫荧光双标染色。 通过免疫荧光双标染色可见，P14d时，BCL．2和BAX的表达位于皮质全层的小 管内，部分小管细胞BCL-2(绿色荧光)和BAX(红色荧光)表达重叠呈黄色， 部分小管细胞只有BCL-2表达。 3、倒扣再包埋切片上BCL．2和BAX阳性表达小管的三维追踪 d和P7 通过追踪显示，E17 dBCL．2和BAX的阳性表达主要位于深层肾皮质 区的近端小管。阳性反应强的肾小管均为成熟的近端小管，发育中近端小管的表 达为弱阳性。远端小管几乎不表达，如有也呈弱阳性。生肾区各结构及肾小体无 表达，髓质到乳头区小管横断面上也有微弱表达。阳性强度为+++的肾小管均为长 髓袢肾单位的肾小管，阳性强度为++的肾小管均为