2、实验理论.pptVIP

实验关键点 诱导和取样时要进行无菌操作。 制备样品时,细菌培养基上清除干净,且要充分悬浮。 每个时间点的样品要立即制样 并做好标记。 如何通过调节IPTG的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？ 思 考 题 下 次 实 验 诱导表达蛋白的SDS电泳检测 开始工作吧！LET’S BEGIN NOW！ * 取样 2011年分子生物学实验 考 试 安 排 科 学 素 质：10% 实 验 操 作：20% 实验结果与报告：40% 实验原理与理论：30% 科 学 素 质 课堂提问 原始实验记录 团队合作 课堂纪律 仪器、用具的使用 台面整洁 考勤 卫生值日 实 验 操 作 1、根据老师的平时观察， 2、通过一学期的强调与要求，以最后两次实验的操作为主要评分依据。 实验结果与报告 根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。 实验原理与理论 考试时间：第13周（5月16日-20日） 考试地点：本教室 考试形式：每个同学按学号单独考试，抽签题目（1+2），口述回答问题，由老师和助教评分。 考试内容： 1、实验原理步骤：分子克隆总流程+10次实验原理步骤（共11个题，抽其中1题详细回答） 2、实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。（抽其中2题简要回答） 实 验 九 蛋白质的诱导表达 背景理论知识 Section 1 9.1.1 实 验 目 的 掌握蛋白质诱导表达的原理 学习蛋白质诱导表达的方法 了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点 外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞 基因工程的最终目的 主要步骤 制备表达载体 制备目的DNA 将目的DNA 克隆到载体上 操作 1. 酶切, 去磷酸化 2. 胶回收纯化 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 1. 目的片断与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌 3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框 蛋白表达操作流程 转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白 1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶 蛋白质表达系统 原核表达系统 真核表达系统 大肠杆菌 枯草芽胞杆菌 YEAST CELL CULTURE INSECT CELL TRANSFERRED GENE 简单,便宜,大量,无修饰 复杂,昂贵, 有修饰 大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。 9.1.2 原核表达的特点 细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体 在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 充分诱导: 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 非诱导条件下: 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录 结构基因：编码?-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。 操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。 9.1.3 乳糖操纵子 9.1.4 诱导原核表达的原理 E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 9.1.5 蛋白原核表达载体 具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Pr