C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建.pdfVIP

· 584 · 医学研究生学报 2015年6月第 28卷 第6期 JMedPostgra，Vo1．28，No．6，June 2Q 论 著 (基础研究) C3a分泌性表达载体及过表达 C3a肾小管上皮 细胞株的构建 郑敬民，尹 广，恽时锋，赵文紧 [摘要】 目的 已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在 C3a／C3aR轴过度活化现象， 但有关C3a／C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达 C3a的。肾小肾小管上皮细胞株 ， 为探讨各种病理情况下C3a／C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。 方法 设计合成人 C3a分泌性表达单元，将其 克隆到慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS—IRES2一EGFP的多克隆位点，构建成 C3a分泌性表达载体 pLenti6．3-C3a-IRES2一EGFP； 将pLenti6．3-C3a．IRES2．EGFP和包装质粒共转染293T细胞，包装成C3a表达重组慢病毒LV—C3a；以LV-C3a感染人肾小管上 皮细胞系HK2，根据 LV，C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点，以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆；利用荧光定量PCR和 ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析 ，从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细 胞株。 结果 ①成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体pLenti6．3-C3a-IRES2一EGFP；②成功进行了重组慢病毒包 装 ，得到了高滴度 (5×10个 ／mL)的C3a表达重组慢病毒LV—C3a；③成功进行了LV—C3a对HK2细胞的转染，得到了稳定转染 LV，C3a的HK2细胞株；基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实，与 HK2细胞比较，HK2一C3a细胞株中C3amRNA表达水平 显著升高[(1．0±0．5) (1321．0±18．0)，P0．01]，分泌的C3a水平显著升高 [(0．3±0．2)rig／mL (249．0±37．0) ng／mL，P0．01]。 结论 成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研 究各种病理情景中C3a／C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞 中的病理意义提供了很好 的细胞模型，也为进一步开展 C3a／ C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。 【关键词】 C3a；C3aR；慢病毒；肾小管上皮细胞；过表达 【中图分类号】 R692 【文献标志码] A [文章编号】 1008—8199(2015)06-0584-06 ConstructionofC3asecrectoryexpressionvectorandtubularepithelialcelllinestablyexpressingC3a ZHENGJing．rain，YINGuang，YUNShi-feng，ZHAOWen-jin (1．NationalClincialResearchCenterofKidneyDiseases，JinglingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine， 2．Departmentof ComparativeMedicine，NanfingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion， A，Nanjing 210002，Jiangsu，China) [Abstract] objective Evidencefrompreviousstudiesindicatedthatover—activationofC3a／C3aRaxisexistedintherenal tubularepithelialcellsofpatientswithrenaldiseasesincludingdiabeticnephropathy．However，thepathologicalsignificanceofover—ac- tivatingC3a／C3aR axisstillremainstobeelucidated．Inthisstudy，weconsturctedarenaltubularepithelialcelllineover—expressing C3ainasecretorymannerinordertoprovideacellmodeltoinvestigatethepathologicalsignificanceofover—activ