超声造影剂SonoVue增强超声辐照介导pEGFP-C1-AFP-tk转染HepG2细胞的实验分析.pdfVIP

‘》中山大学岳殿超博士论文 HepG2细胞的实验研究 博士研究生：鬻殿超 导 师：吕明德教授 中山大学附属第一医院影像医学与核医学(广州510089) 中文摘要 随着分子生物技术，尤其慕因技术和理论的飞速发展，基因治疗在肝癌治 疗中的研究越来越深入方法。如何安全肖效地介导瓣的基因转染入靶细臆是基因 治疗的关键步骤。近年来研究表明超声选影翔作为一种辅剂能进一步提赢超声介 进超声介导基因转染的作用具有较大豹潜力。在超声局部辐照的作用下，造影剂 微泡通过空化效应，提高纲胞膜的通透性，使得载体携带匿的纂因，能有效地进 入靶纲胞内。 virus kinase 单纯瘛疹瘸毒I型的胸腺激酶慕因(herpessimplexthymidine typer1，HSV-1一tk)是目前使靥最为广泛的自杀纂因。本课题通过体外实验探讨 超声造影剂增强超声辐照对增加HepG2细胞膜逶透性的可能性；薰组构建含甲 胎蛋白(alpha 粒的效能，为建立超声造影剂增强超声辐照介导豹_鞋手瘸基因治疗的新模式奠定初 步的实验基础。 {》孛蠡太攀撩鼹趣簿±论变 第一部磐 声落拣(SonoVue)潜强怒声鞲熙瓣HepG2绷胞膜通逶髅麓影碗 一、 材料舞秀法 蘩凄楚赣黪专瓣涎2霹魏臻潜蔽。人翳畿懿癌缨魏穆HepG2逡孛斑丈孥动魅 25瓣，夔鬻≥，楚羲连续多饕耱搽 mg／ml。彩最多蛰戆整声痰稼纹(HP-Viewpoint 头，灏率1．9 nfff，攘收波长520am，功率15mW。 察骧方法黧下： 搬蠖EDTA)穗穗，终蠡溪鬣毯1000r／tri溆枣§5藤箍。疼主薄，瑟禽10％FBS 薅莽液熏赣裁簿绥臆慧渡荠璜养3h瑟，誊赣籍孬缀藏懑液，麓入2毒毳臻莽扳 肉，绷胞数1．5×105／孔。每孔加入荧光标诹物FD一500S 50／*1(10mgml)。酝铺 好缎骢悬液磊嚣穆钱越声照射场褥辍照实验。 。 ●SonoVue滚熬凝：取tralPBS缓漫注入SonoVue潍手耱瓶褒，嚣器豢臻。 使题藏震力攘摇滋产黛徽灌。 ●臻照蜜黔努联缀： SO越，不避行越辫辐照；e组(舻s)：越声绷照，辐黧甜润60秒，撵头频率1．9 SAT．瓷80．0mW／emZ：D筑《砖《)； 溉，TIS黉鬟兔虢8，瀵蓥舞80％，赣窭声强i 瑟黧SonoVue(瓣露鼹B缝)厨，滏褥越矽辗照≤辐慧袋律辩e缱)。 纲胞膜通遴憾检测：辐照蜜验焱毕，邸剡用PBS戚蕊洗涤、懋浑、高速离 心敷狳簿缨蕤羚FD500。蟋滚式缨熬傻梭溺焚竞袋爱辩搜鹣缨藤(FD500遂入缓 鼹蠹≥，每强搽本稔涎10000争缀熬，毒i--g辍整率。 ：、 缝暴 t， 氍 ‘》巾出丈学丞毁瓣耩圭论文 臆活性率大予95％。 2． 滚式绥臆仪测定的荧光染色瓣魅纲飚谣分率分别为：无超声辐照(A C缝眈较P，j、于0．05)。 第：豁分 熏组真核衮达质敉pEGFP-CI-AFP-tk的梅建 一、 耪料 Marker 主要试裁存鞭i魏d燃，XhoI，SalI袋捌拣内切懿、T4DNA连接酶，DNA 试剂盒、凉脂糖凝胶网收DNA片段试剂愈、小爨基因组DNA极速抽提试翔盒 DNAfast2000，跌及胰鬣彝胨，酵母提取秘，骧鼹，氮苄毒霉素，卡薅霉素，DMEM、 骆牛巍清，箕它豫学分辑纯试裁。