成肌细胞促进骨髓间充质干细胞定向分化及机制的实验分析.pdfVIP

成肌细胞促进骨髓间充质干细胞定向分化及其机制的实验研究 摘要 成肌细胞促进骨髓间充质干细胞定向分化 及其机制的实验研究 专业：神经病学 博士生：李美山 导师：张成教授 中山大学附属第一医院神经科，中国广州510080 摘要 muscular 杜兴氏肌营养不良症(Duchennedystrophy,DMD)是一种表现为肌 肉进行性萎缩的X染色体连锁的隐性遗传病，在出生的活男婴中发病率为1／3500。 典型的DMD病人表现为血清中肌酸激酶的水平明显升高，伴有肌肉的无力，行 走时左右摇摆(鸭步)；随之而来的是小腿肌肉的假性肥大，近端肢体肌肉无力， 以及Gower’S征阳性。患儿一般在12岁时开始卧床，在20岁前后肌肉变性加剧， 变异所造成，导致了该蛋白的缺失或异常表达。mdx鼠作为DMD的动物模型被广 泛用于对该病病理机制以及基因和药物治疗方面的研究。 对DMD的治疗策略通常包括细胞治疗、基因治疗和药物治疗。细胞治疗以 成肌细胞移植和骨髓干细胞移植为主。通常认为，成肌细胞移植通过转运正常基 因到骨骼肌，并增加骨骼肌的成肌能力而发挥作用。并且在动物实验中取得了一 定的效果。然而，临床实验显示，在接受成肌细胞注射的病人身上没有观察到客 观的改善。因此，从某种意义上来说，对成肌细胞移植的研究，需要更多设计缜 密的实验来进一步论证，对其高效的成肌能力及其分化机制的研究将是未来的方 向之一。 已经证明在骨髓移植以后，骨髓来源的成肌前体细胞可以向损伤的肌肉组织 或mdx鼠病变肌肉迁移并参与其再生。但研究也发现，骨髓细胞中只有一小部 分细胞能够参与到骨骼肌纤维的再生过程中。临床研究发现，在接受骨髓移植 10年后的DMD病人，尽管可以在肌纤维上发现来自供体的细胞核，但并没有发 现dystrophin的显著表达。目前认为，骨髓干细胞移植的效率较低的可能原因有： 成肌细胞促进骨髓间充质干细胞定向分化及其机制的实验研究 摘要 骨髓细胞募集到病变肌肉的能力较差、化学信号强度不足、干细胞对局部信号的 反应不良等。尽管目前在临床应用方面尚存在一定的限制，但由于其具有易于分 离和扩增、多向分化潜能和低免疫原性等优点，骨髓干细胞成为治疗DMD最有 希望的手段之一。 stemcells，MSCs)成肌分化和移植效 针对骨髓间充质干细胞(mesenchymal 率较低的情况，本研究采用与成肌细胞共同培养的方式，模拟体内的成肌微环境， 促进MSCs的成肌分化及其移植效率的提高。通过移植共同培养后的细胞，寻找 提高MSCs移植效率的新途径，为将来的临床应用奠定理论基础。同时，初步研 究在共同培养条件下，成肌细胞促进MSCs成肌性分化的可能机制。 1．材料和方法 1．1实验动物 SD大鼠作为MSCs供体鼠，正常野生型C57鼠作为正常对照，未经移植的 mdx鼠作为阴性对照，将mdx鼠下肢肌肉(胫前肌和腓肠肌)的左右侧分别作 为共同培养组和单独培养组细胞局部注射移植处。选取6—8周龄的mdx鼠进行移 植，分别于移植后2、4、8、12和16周取材。在细胞移植过程中死亡的mdx鼠 退出试验，保持各组和各时间点动物为3只左右。 1．2MSCs、HEK293细胞和C2C12成肌细胞的培养 取SD大鼠骨髓做原代培养，再用差速贴壁法分离、扩增及纯化MSCs，再 用流式细胞仪(FCM)进行表面抗原鉴定，将形态一致的P4—6代MSCs用于 细胞生长至70～80％融合时，可传代或用于共同培养。 1．3Ad．eGFP的扩增、纯化、鉴定和转染 当接种过构建有增强型绿色荧光蛋白腺病毒(Ad．eGFP)的293细胞出现病 变效应(CPE)后，可以收获病毒。用CsCl2梯度离心法纯化病毒，用TCID50 检测方法测定病毒滴度。提取病毒DNA，进行E2b区的PCR检测。按照感染复 数的不同分别接种相应剂量的Ad．eGFP，用FCM检测转染效率。 1．4MSCs和C2C12成肌细胞的共同培养 2％马血清的DMEM培养。