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柞蚕丝素蛋白的阳离子化及其用作基因载体的初步研究 中文摘要 柞蚕丝素蛋白的阳离子化及其用作基因载体的初步研究 中文摘要 促进微血管网络的再生，提高支架的成活率，是皮肤真皮等含血管组织的再生修 复领域需要亟待解决的关键问题。将分子生物学和组织工程技术相结合用促进血管再 生的生长因子基因转染细胞，使相应的生长因子得到稳定、高效表达，是促进血管再 生的有效途径。VEGF165和Ang-1是两种最重要的且仅以血管内皮细胞为靶细胞的促 血管再生生长因子。研究证明联合使用Ang-1和VEGF165双基因既有利于相互协调共 同促进血管的形成，又可使新生血管获得持久稳定的结构。寻找合适的可降解性生物 材料作为基因传递载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗血管再生 及皮肤组织工程等领域共同关注的问题。 柞蚕丝素是一种低免疫原性的物质，能被完全降解成多肽和游离氨基酸。柞蚕丝 素蛋白含有细胞特异性黏附RGD 序列，且含有较多的带极性侧链的氨基酸残基能够 作为化学改性的潜在反应位点，这些优点及特性为柞蚕丝素蛋白作为基因载体的可行 性提供了物质基础。 本文用精胺对柞蚕丝素蛋白进行化学修饰，使改性后的柞蚕丝素蛋白在生理环境 下带正电荷，得到阳离子化的柞蚕丝素蛋白(CASF) 。并以阳离子化的柞蚕丝素蛋白 作为VEGF165 和Ang- 1 双基因共表达质粒的传递载体。 首先通过碳化二亚胺法(EDC)使精胺接枝于柞蚕丝素蛋白。Zeta 电位分析结果表 明，经精胺改性后，相同pH 条件下水溶液中柞蚕丝素蛋白的Zeta 电位从负值上升到 7.92，当精胺与柞蚕丝素的质量比大于8%后，丝素的Zeta 电位上升幅度减小。红外 吸收光谱显示精胺与柞蚕丝素蛋白中羧基反应，生成酰胺键。三硝基苯磺酸法(TNBS) 证实了修饰过后的柞蚕丝素蛋白中伯氨基含量有所增加。并且精胺改性后，柞蚕丝素 蛋白的分子构象发生了无规卷曲和α-螺旋结构向β-折叠结构的明显转变。 其次采用碱裂解法提取质粒 DNA，并通过静电吸附制备阳离子化丝素/DAN 复 合物。研究结果表明，阳离子化的柞蚕丝素能与DNA 形成带正电的复合物，并且形 成的复合物为紧密的颗粒状，粒径分布在100-500 nm 。 I 中文摘要 柞蚕丝素蛋白的阳离子化及其用作基因载体的初步研究 最后MTT 法检测复合物的细胞相容性，研究结果表明用阳离子化的柞蚕丝素包 被质粒DNA 比用PEI 包被质粒DNA 的细胞毒性小。激光共聚焦显微镜(LSCM)和流 式细胞仪检测 GFP 阳性细胞比率结果表明，阳离子化的柞蚕丝素蛋白可以作为 VEGF165 和Ang-1 双基因共表达质粒的传递载体，并且C -ASF/DNA(48:1)组的复合 8 物转染L929 细胞与hy.EA926 细胞的转染效率分别为 15.28%，32.88%，均明显高于 PEI/DNA 组的转染效率。 通过本文的研究，首次使用阳离子化的柞蚕丝素蛋白共同作为VEGF165 和Ang-1 双基因共表达质粒的传递载体转染成纤维细胞、血管内皮细胞，研究结果表明阳离子 化的柞蚕丝素蛋白可以用作基因传递载体，为组织工程及原位组织再生领域的血管再 生提供了一种新的基因传递载体。 关键词：柞蚕丝素蛋白；阳离子化；基因转染；基因载体；血管化 作 者：扈永培 指导教师：李明忠 II Study on the Cationic Antheraea pernyi Silk Fibroin as a Non-viral Vector Abstract Study on the Cationic Antheraea