奶牛β-酪蛋白增强子对启动子活性影响的初步分析.pdf

奶牛j8l一酪蛋白增强子对启动子活性影响的初步研究 摘 要 【目的】 启动子活性常通过观察报告基因(r印ortergene)的表达来进行分析，而目 nuoresc锄t 前常用的荧光素酶(1ucif咖se，Luc)基因和绿色荧光蛋白(鲈en protein，GFP)基因都有各自的优点和局限性。本研究希望通过构建荧光素酶和 绿色荧光蛋白融合表达(Luc．GFP)载体来综合两者的优势，为启动子活性的分 析提供一种简便、高效、稳定和灵敏的检测方法。另外，启动子的活性受多种转 录因子的调控，本研究运用生物信息学方法，通过对转录因子结合位点的分析预 beta，CSN2)的潜在增强子序列，并通过将潜 测获取奶牛p．酪蛋白基因(casein 在增强子序列与p酪蛋白启动子一道构建报告基因表达的重组载体而分它对p 酪蛋白启动子活性的影响，期望获得乳腺组织特异性的增强子，为奶牛乳腺生物 反应器的构建或优化创造条件。 【方法】 通过质粒的双向环状PCR定点突变，将pGL3．B勰ic载体上原有的皿ⅥI识 别序列替换成风f Splicingbyov甜ap I识别序列。应用重叠延伸PCR(gene exteIlsion luci衙嬲e，FL)基因(觑c+)、 PCR，SOE．PCR)将萤火虫荧光素酶(firefly 6×llis标签(1lis nuorescent tag)序列和增强型绿色荧光蛋白(enhaIlcedgreen 定向插入到含有不同B．酪蛋白基因启动子的重组载体中，构建成荧光素酶和绿色 荧光蛋白融合的表达载体。另外，将胁c+替换成PG即，构建成以P钮P为报告 基因的报告载体。通过三种不同报告基因的检测方法检测B．酪蛋白基因启动子的 列，通过三种转录因子结合位点的在线预测分析工具分析CSN2上游 ．3177bpl609bp区的转录因子结合位点，筛选最可能含有增强子的潜在增强子 序列。将潜在增强子序列插入到B．酪蛋白基因启动子上游，构建成含有潜在增强 子的重组增强子载体，通过双荧光素酶报告系统检测，分析潜在增强子的功能。 【结果】 (1)成功将萤火虫萤光素酶报告载体pGL3．Basic中的勋口I酶切识别位点替 换成风fI位点而获得不含硒口I酶切识别位点的萤火虫萤光素酶报告载体 I— pGL3-一风fI—Basic、叩l巾GL3·风fI·B撕c、q)2-pGL3珊fI-BaSic、印3-pGL3珊f I—Basic和 BaSic、叫一pGL3璃fI-Basic、rp5-pGL3协fI—BaSic、rp6-pGL3珊f I．BaLsic； opO—pGL3．风f (2)运用重叠PCR技术成功地拼接了融合基因觑c+．6×JIl西一e钮P，构建了含不 BaSic； (4)以双荧光素酶报告系统及绿色荧光蛋白基因报告载体对6种重组p一酪蛋 白启动子引导荧光素酶或绿色荧光蛋白基因表达的活性进行分析测定，结果显示 重组p-酪蛋白启动子rpl的表达效能最高，其引导荧光素酶表达的活性是原始p一 酪蛋白启动子0pO活性的160％。 (5)查找了奶牛p一酪蛋白基因转录起始位点上游一3000bp左右的调控序列，采 用三种转录因子结合位点的在线预测工具对．317卜1609区进行增强子B．酪蛋白 预测分析，最终筛选出．1885～1745区域内一段长141bp的序列为潜在增强子序 列，并将其克隆至重组载体中p．酪蛋白启动子的上游，构建成重组增强子载体 和Ellllanc*0pO-pGL3．B嬲ic。 (6)采用双萤光素酶报告系统对7种重组增强子载体的分析测定结果显示，插 入潜在增强子序列后，所有重