罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用.pdfVIP

第 36卷 第 4期 渔 业 科 学 进 展 VO1．36．N0．4 2015年 8 月 PR0GRESS IN FISHERY SCIENCES Aug．，2015 DOI：10．11758y／ykxjz．20I50414 http：／／www．yykxjz．cn／ 罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)幼体 病原肠杆菌 PCR检测技术的建立与应用术 陈雪峰 杨国梁① 高 强 夏正龙 濮剑威 慎佩晶 黄振远 (浙江省淡水水产研究所 国家罗 氏沼虾遗传育种中心 浙江省淡水水产遗传育种重点实验室 湖州 313001) 摘要 根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)@体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌 ompA 基因序列、产气肠杆菌gryB基因序列设计特异性引物，通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异 性和敏感性试验，建立了两种病原菌的PCR快速检测方法，并对发病样品进行了检测。结果显示， 设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385bp和201bp的特异 性片段，与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为 10CFU／ml和 10CFU／ml。 罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致，建立的检测方法也可直接对样品进行 PCR检 测，而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌 PCR检测方法具有较高的特异 性与灵敏度，可缩短检测时间，该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调 查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。 关键词 罗氏沼虾；阴沟肠杆菌；产气肠杆菌；PCR检测 中图分类号 $941 文献标识码 A 文章编号 2095．9869(2015)04—0099．06 罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii)为世界最 在幼体培育至 3-4d即表现出明显病症 ，在培育到第 大淡水虾类，具有重要的经济价值，它是世界上许多 7天，幼体倒池后发生大量死亡，故该病亦被形象称 热带和亚热带地 区内陆水产养殖中最重要 的经济 甲 为 “7日病”。在随后几年的流行病学调查中，该病在 壳动物之一(杨国梁等，2008)。目前，我国是全球罗氏 部分育苗场依然时有暴发。浙江省淡水水产遗传育种 沼虾产业最大国，相关产值在 60亿元以上(Yangetal， 重点实验室通过反复的人工回感实验 ，发现导致罗氏 2012)。浙江省湖州市是我国最大的罗氏沼虾育苗基 沼虾幼体发病 的主要细菌性病原为阴沟肠杆菌和产 地，年育苗量 占全国罗 氏沼虾虾苗生产量的 60％以 气肠杆菌(结果待发表)。为有效遏制疾病发生、减少 上。2009年，我国罗氏沼虾养殖产量达 14．4万t，创 经济损失，迫切需要建立一种特异、敏感的检测方法， 历史新高 。然而 ，在罗氏沼虾产业快速发展的同时， 以实现病原的快速诊断与针对性防治 。 因苗种供不应求而出现的跨省、跨区域的调苗所带来 的疫病风险于 2010年在全国罗氏沼虾育苗场暴发， 1 材料与方法 此病危害特别严重，90％以上的罗氏沼虾育苗场因相 1．1 材料 继感染发病而停产，造成主要育苗区的直接经济损失 达 2亿元。该病主要表现为：幼体培育到第7天时， 1．1．1 菌株 本实验所用菌株阴沟肠杆菌(Entero— 食欲和活力下降，空 胃，颜色发黑。情况特别严重时， bactercloacae)315B 株、产气肠杆菌(Enterobacter 国家科技支撑计划项 目(2012BAD26B04)、浙江省重大科技专项 (2012C12907)、浙江省淡水养殖重点科技创新 团队 项 目(2010R50026．02)和湖州市重大科技专项(2011ZD2005)共同资助。陈雪峰，E．mail：chenfenghailan@126．com