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植物细胞培养 细胞培养与组织培养的区别 1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议： 组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。 细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 细胞培养培养类型 根据培养规模：小规模和大批量培养 根据培养方式：悬浮、平板、看护培养 根据要求产物：用于诱变和生产次生(级)产物(Secondary products)的细胞培养 悬浮培养单细胞培养细胞规模化培养培养细胞的次级代谢及产物积累 悬浮培养（Suspension culture） 悬浮培养 是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。 细胞悬浮培养的应用 细胞悬浮培养的建立 愈伤组织的诱导 选择适宜的外植体： 幼胚 下胚轴 子叶 选择适宜的培养基：MS，B5，N6 较高激素浓度 必要的附加物质 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎 悬浮系的建立与培养 成功的悬浮细胞培养体系特征 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加一倍。 悬浮细胞的生长动态 悬浮细胞生长的衡量 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量 影响悬浮细胞生长的因素 起始愈伤组织的质量 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。 最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。 培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。 影响悬浮细胞生长的因素 培养基 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。 基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基设计时，一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 植物激素和其他附加成分的应用。 影响悬浮细胞生长的因素 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养 温度 25℃ 继代周期 指具有一定起始密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。 继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。 悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。 什么措施？ 饥饿法 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。 抑制剂法 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。 用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。 利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。 分选法 依据：细胞体积大小 方法 常规分选方法是梯度离心 精细的分选可采用流式细胞仪 优点 操作简单 分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用 缺点 分选精细度较差 低温处理 可以提高培养体系中细胞同步化的程度 Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。 梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。 可能的原因 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影