第八章亲和纯化技术精品.pptVIP

亲和纯化 * 外源凝集素亲和电泳 利用外源凝集素对目标蛋白质的特异性作用进行亲和电泳。 适用于分析血清糖蛋白。 * 毛细管亲和电泳 将亲和技术应用于毛细管电泳——毛细管亲和电泳。 原理：根据底物、配基、与底物-配基复合物的迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定Kd或Kb。 用于手性药物及DNA片段的特异性分离。 * * （四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。 * 六、 配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接 * 七、 亲和层析的吸附和洗脱 影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生 * （一）、影响吸附的条件 亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。 * 非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。 离子效应 疏水基团 复合亲和力 * 离子效应 配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。 具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。 * 疏水基团 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。 疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基： * 复合亲和力 离子效应作用，又有疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。 * （二）、亲和层析的洗脱 洗脱： 洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱 * 非专一性洗脱 改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化. 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序Cl－I－CF3COO－SCN－ CCl3COO－。 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。 * 特殊洗脱 裂解配基与载体的连接键。 断裂方法有： 硫酯键用羟胺处理30分钟； 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理； 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。 * 专一性洗脱 S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） （1）竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。 （2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不影响E对S的结合，非竞争性效应。 （3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密（负洗脱） 。 * 反竞争性效应 * 亲和层析中配基的选择和洗脱条件 * （三）、亲和吸附剂的再生 用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。 * 八、其他亲和层析 金属离子亲和层析 有机染料亲和层析 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC） * 第二节 其他亲和纯化技术 一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳） * 一、 亲和过滤（Affinity Filtration） 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。 亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。 * 亲和错流过滤 （affinity Cross Flow Filtration） 基质及大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。 * 基质 聚丙烯酰胺 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞） 琼脂糖、脂质体等 酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A * 亲和膜 （affinity membrane） 亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。 * 亲和膜优点 传质阻力小，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基用量低； 压降小，流速快； 设备体积小。 *