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蛋白酶体抑制剂和活化剂的初步筛选 蛋白酶体抑制剂和活化剂的初步筛选 硕士研究生：沈守星 导师：刘金保教授 中文摘要 背景与目的 system，UPS)介导了细胞内 泛素一蛋白酶体系统(ubiquitin—proteasome 多种蛋白的降解，从而参与细胞生命过程的调节。 由于该系统的发现及其重要 性，以色列及美国的三位科学家共同分享了2004年度诺贝尔化学奖。蛋白酶体 本身已经成为抗肿瘤药物、组织缺血一再灌注损伤、免疫调节、糖尿病治疗的重 要靶点。经美国FDA批准蛋白酶体抑制剂PS一341已经进入II期临床应用于肿瘤 的治疗，并取得了比较理想的治疗效果。寻找蛋白酶体抑制剂对于开发我国中医 药资源具有重要的应用前景，2006年6月在美的中国学者首次报道了雷公藤成 分Celastrol是一个蛋白酶体抑制剂，引起了学术界的广泛重视。本研究旨在建 立蛋白酶体抑制剂的筛选平台，并利用此平台对中化药物和生物毒素进行筛选， 希望能筛选出一些蛋白酶体抑制剂，为多种疾病治疗提供新的药物治疗手段，同 时也为UPS的功能研究提供帮助。 方法与结果 1． 进入筛选药物的入选条件： 目前报道的蛋白酶体抑制剂归结起来有以下几个特征：多数具有芳香酮体结 ketone 构(aromaticstructure)；具有抗肿瘤作用，特别是对血液系统肿瘤 的作用明显；具有诱导细胞凋亡的作用；导致泛素一蛋白酶体系统底物蛋白质细 胞内积聚并致细胞稳态失衡。 2． 蛋白酶体抑制剂初筛平台的建立： Z-LLE-betanaphthylamide(NA)及BZVGR-AMC。 ．1． 蛋白酶体抑制剂和活化剂的初步筛选 根据进入筛选药物的条件，我们初步选出52个中药进行实验，实验中采用 培养的NIH3T3细胞的裂解物作为蛋白酶体供体，细胞裂解物(10pg蛋白)与不同 用荧光分光光度计测定底物发出的荧光强度，以示蛋白酶体酶活性的变化。 通过上面初步筛查，我们发现EPI-001、紫草素、姜黄素、黄岑素、大黄酸、 淫羊藿苷组随着药物浓度升高，其底物发出的荧光强度明显下降；滨蒿内酯、葛 根素组则明显上升，其中已有学者报道姜黄素是一个蛋白酶体抑制剂。由于某些 药物能够自身淬灭荧光和自发荧光，为了明确检测到的荧光强度的下降或上升究 竟是药物对蛋白酶体的抑制或激活作用还是药物自身淬灭荧光或自发荧光的作 用，我们接着对这几种药物进行了药物自身淬灭荧光和自发荧光对照实验。 2．2药物自身对淬灭荧光和自发荧光的作用 2．2．1药物自身淬灭荧光对照实验：实验中采用3T3细胞裂解液作为蛋白酶体供 充分反应后，无水乙醇终止反应，然后再加入不同剂量的中药，一段时间后，检 测荧光强度的变化。 结果发现EPI-001和紫草素组底物发出的荧光无明显变化，排除了药物自身 淬灭荧光的作用；而黄岑素、大黄酸、淫羊藿苷组则随着浓度的升高，其荧光强 度明显下降，说明这三个药物具有淬灭荧光的作用。 2．2．2药物自发荧光对照实验：实验中也是采用3T3细胞裂解液作为蛋白酶体供 体，但是不加入荧光底物，直接加入不同剂量的药物，一段时问后，检测荧光强 度的变化。 结果发现随着滨蒿内酯、葛根素组药物浓度的升高其荧光强度也明显升高， 说明这两个药物能够自发荧光，排除了能够活化蛋白酶体的作用。 通过上面的实验，我们初步认为紫草素和EPI-001能够抑制蛋白酶体 Trypsin-like酶无明显抑制作用。 ．2． 蛋白酶体抑制剂和活化剂的初步筛选 2．4药物对纯化20S蛋白酶体的作用 为了排除其他一些物质的干扰，我们选用纯化的20S蛋白酶体代替3T3细胞 裂解液作为蛋白酶体供体，实验结果与采用NIH3T3蛋白裂解物试验一致。 2．5药物对活细胞蛋白酶体的作用 以上皆是在体外检测药物对蛋白酶体酶活性的影响，为进一步确证并排除体 外化学物质的假象作用，最后我们在活细胞层面检测EPI一001对细胞内蛋白酶体 酶活性的作用。培养的3