藻酸双酯钠的分级制备及生物活性的研究.pdf

蠢酸双酯钠的分级制备及其生物活性研究 藻酸双酯钠的分级制备及其生物活性研究 摘要 多糖的生物活性、化学结构以及构效关系的研究已成为多糖领域的前沿 阵地，并且取得了很大的进展。其中，关于一些相对分子量在几千以上、 强生物活性多糖的研究日益受到重视。 本文以我国自主知识产权的海洋多糖药物藻酸双酯钠(PSS)作为研究对 象，采用超滤及低压柱层析方法对其分级制备，分离得到具有相似骨架、 磺化度及不同相对分子量(版，)的分级产物；通过对各分级产物进行抗凝 血活性、免疫调解作用、保护神经元细胞凋亡、抗菌、降糖等生物活性的 考察，探讨PSS的链长与活性的关系，为PSS的广泛应用及多糖构效关系 的深入研究进行有益鲢搽索。 研究结果如下； 1、低压柱层析法以ScphadexG100作为分离介质，对PsS(Mw：17．19 kDa)进行分离，高效凝胶渗透色谱法测定产物重均分子量(Mw)，得到 ^毛分别为51．95，25．62．11．76，5．41kDa4个分级产物(Z-PSS：I--4)；以截 kDa的超滤膜分级PSS，得到旃分别为 留分子量分别为30，10，5，3，1 kDa 21．97，20．25，18．27，11．35，4．93，3．336个分级产物(C-PSS：I-6)。 Flask Met,hod)测定所有分级产物磺化度多在1．2-1．3 氧瓶燃烧法(Oxygen 代发生在糖环於C-2，C-3，酯化取代发生在C-6。 2、分级产物生物活性比较研究： 2．1、PSS及柱层析分级产物Z螨S：1．4抗凝血实验(凝血三项：凝血 酶原时间PT，活化部分凝血活酶时间APTT’凝血酶时间TT)显示：PSS 及4个分级产物延长TT时间作用最强，其次为APTT，延长PT时阃作用 最弱，以上结果通过与对照组比较，t-lgst，显示统计学差异(p0．05)。4 个分级产物抗凝活性比较显示，抗凝血作用与分子量显著相关，不同的凝 血指标对分子量的要求显著不同，AFTT显著随PSS分级产物分子量的降 低而降低。 一步证实了柱层析分级产物凝血三项实验结果：样品对TT作用最强，APTT 次之，对PT作用较弱，而且活性大小与样品的分子量显著相关。 2．3、在凝血三项实验的基础上，进一步验证了PSS及柱层析分级产物 FIIa因子发挥抗凝血作用，强度与低分子肝素类似；对FXa作用较弱。各 分级产物抗凝血因子作用比较显示，作用强度与分子量显著相关，随着分 级产物Z-PSSl--4分子量的降低，抗凝血因子作用显著降低，Z-PSS4失去 抗FXa作用。 2．4、抗蜂毒肽(Mastoparan)诱导的大鼠原代神经元细胞凋亡实验结 果显示：PSS对Mastopam诱导的大鼠子鼠原代神经元细胞漏亡有显著的 保护作用，其分级产物Z-PSSl．3也表现出对凋亡神经元细胞的保护作用， 而Z-PSS4没有这种作用，证明该作用有最低糖链片断要求，但并不会随糖 链长度的延长而保护作用增强。采用Huo-3／AM荧光探针技术标记胞内钙 离子，测定胞内钙离子浓度变化，推测PSS保护神经元细胞的凋亡作用机 制是抑制胞内钙释放． 2．5、本课题对PSS及Z-PSSl-4的免疫调节作用进行了细胞水平的研究。 主要考察样品对小鼠脾脏细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、刀豆蛋白A (ConcauavalinA，Con LPS)诱导的B-Ceil的作忍，探讨PSS及分级产物的免疫调节作用。实验结 果显示，PSS能增强脾脏细胞的增殖作用，抑制ConA诱导的T．Cen和LPS 诱导的B-Cell增殖，同时能够促进巨噬细胞的吞噬功能。对于脾脏细胞的 作用，PSS分子量在10-20kDa之间较显著：对于促进巨噬细胞吞噬功能， 显示PSS分子量最大分级产物作用最强。 2．6、以革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌．大肠杆菌作为 果显示：PSS及Z-PSS：1．3，C-PSS}-4对金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果， Ⅱ 藻酸双酯钠的分级制各及其生物活性研究 片断具有较强的抑菌作用：同时Z-PSS4及C