肝脏再生调控相转录因子间相互作用网络的初步研究.pdf

摘要 肝脏再生调控相关转录因子间相互作用网络的初步研究 摘 要 肝脏是人类少数具有再生能力的器官之一，肝脏再生是生物体进化 而来的一种自我保护措施。目前对于肝脏再生研究表明，肝脏再生过程 可以分为三个阶段，即启动、再生与终止，但这三个阶段的发生、发展 机制均尚未被彻底阐明。对于肝脏再生的认识也经历了三个过程，首先 人们认为肝脏再生过程是以某一个蛋白因子为开关，一旦触动这个开关， 肝脏再生过程就按照设计好的程序依次展开，直到再生完成而终止；后 来人们认识到这个过程的复杂性，不是某一个蛋白能够决定的，而是某 一条通路起到关键作用，但是事实上依然解释不了这个过程中的众多谜 团；最后，人们认识到肝脏再生远比想象的还要复杂，它是一个多条信 号通路参与、相互影响、相互作用的最终结果。在上述不同阶段的理论 指导下，以往对于肝脏再生的研究都集中在某一个或几个单独的细胞因 子或通路，而近来的研究则更注重宏观层面的研究，试图从全基因组来 认识这个现象。本文在这种研究背景之下，采用酵母双杂交的方法绘制 了肝脏再生过程中相关转录因子的蛋白相互作用图谱，试图从蛋白质互 作网络的整体水平揭开肝脏再生的秘密。 本文研究内容及结果主要包括以下几个方面： 1肝脏再生过程中转录因子的筛选：首先，在全基因组水平筛选调控 摘要 对细胞生长的刺激或抑制作用。通过单个ORF转染SMMC7721细胞， 发现一批能够控制细胞生长的因子，其中包括129个转录因子。同时， 430 本实验室还采用小鼠CCl4导致肝损伤的模型，以genechip⑩mouse 2．0芯片检测了肝损伤过程中mRNA水平的基因表达谱。以芯片数据分 析即mRNA的表达水平变化，以及上述细胞生长筛选出的129个转录因 子为基础，选择了32个既能够刺激或抑制肝癌细胞生长，又在肝脏再生 过程有表达量上调或下调的变化的ORFs，包括27个转录因子和5个磷 酸激酶。经过这两个条件筛选，选择的32个ORFs编码蛋白与肝脏再生 的调控被认为密切相关。 2转录因子相互作用网络的绘制：首先，将32个ORFs分别克隆到 与Y187，经氨基酸缺陷培养基筛选阳性克隆后，分别得到32个“诱饵 和“猎物”蛋白。第二步将每一个“诱饵蛋白与每一个“猎物蛋白 进行报告基因自激活检测，共发现三个“诱饵蛋白和两个“猎物蛋 白即BD．HBP1、BD．STAT3、BD．FOXMl、AD．FOXM1、AD．REA具有 自激活能力，故这几个“诱饵和“猎物蛋白被排除在下一步一对一 矩阵杂交之外；通过870次酵母双杂交．矩阵杂交实验，采用HIS3、LacZ、 ADE2三个报告基因的平行测试，共发现64对相互作用，即至少激活一 个报告基因的表达，依据对报告基因激活程度的鉴定又将这些相互作用 按照强度分为I、II、III和Ⅳ四类，共得到18对I级、9对II级、21对 III级和16对Ⅳ级相互作用，最后运用这些数据绘制出一张与肝脏再生相 关转录因子间的蛋白互作网络图。 3转录因子相互作用网络质量的验证：为了验证蛋白互作网络的可 摘要 靠性和真实性，采用与其它蛋白互作图谱比较、体外结合试验以及p．半 乳糖苷酶活性定量测定的办法检验了该网络的质量。通过与其它蛋白互 作图谱对比发现，选择的32个ORFs中多个没有被提及，但是结果与已 发表的结果相比有很高的相似性： 通过免疫共沉淀 (Glutathionine．S．transferase Pull．down，GSTPull．down)对通过酵母双杂 交获得的64对相互作用中的13对进行进一步验证。将这13对互作的 ORFs克隆到真核表达与原核表达载体，分别在大肠杆菌和HEK293T细 胞中进行表达，然后运用Co．IP和GSTPull．down方法，证实了其中11 对相互作用；采用p．半乳糖苷酶活性定量测定的办法不仅再一次验证了 互作，还量化了相互作用激活报告基因的程度。通过以上实验，证实了 酵母双杂交所获得的相互作用的基本可靠性，以及由此绘制出的肝脏再 生过程中转录因子互作网络的真实可靠性。 4转录因子相互作用网络在肝脏再生过程中的作用分析：对