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炎症损伤反应学说 CD14的生物学特性 CD14(LPS受体) 为细胞表面糖蛋白，分子量为5.5×104，由375个氨基酸残基构成 表达于活化的单核-巨噬细胞表面，可诱导内皮细胞产生粘附分子，参与白细胞的黏附与聚集，它在免疫、炎症及脑动脉粥样硬化的形成过程中起着重要作用 可刺激巨噬细胞产生炎症细胞因子，加重炎症反应；可诱导巨噬细胞和内皮细胞释放具有促凝活性的物质等,促进血栓的形成。 CD14基因染色体定位及分子结构特点 本课题研究目的 从基因水平探讨CD14基因多态性与脑卒中的关系 试图从分子遗传学角度阐明脑卒中的发病机制 对早期诊断和预防脑卒中具有重要意义，为脑卒中的基因诊断和治疗提供重要的理论依据。 本课题研究的主要内容 建立CD14基因型的检测方法，研究汉族健康人群CD14基因型的分布情况，并与其它种族人群研究结果比较。 研究脑卒中患者CD14基因型及等位基因的分布情况，并与年龄匹配的正常对照组比较，分析各组人群CD14基因型，探讨CD14基因多态性与脑卒中的相关性多态性位点。 研究脑卒中患者CD14基因型与血清CD14水平及血脂水平相关性，揭示CD14基因多态性与血清CD14水平及脂质代谢之间的关系，探讨致脑卒中是单一因素还是多因素联合作用的结果。 本课题研究的主要内容 在上述研究的基础之上，选择与脑卒中相关的CD14基因型个体，探讨不同基因型对外周血单个核细胞功能的影响；以及CD14mRNA和蛋白在上述细胞中的表达情况，揭示CD14在脑卒中发生、发展中的免疫调节作用。 对多个基因位点进行连锁分析，筛选出脑卒中可能的易感基因型和致病基因。 材料和方法 1.主要材料 2.研究对象 3.实验方法 4.基因型判断 5.统计分析 1.主要材料 试剂：4种内切酶、Taq酶、CD14血清试剂盒等 引物设计与合成 ①CD14（-159） P1：5-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3 P2：5-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3 ② CD14（-260） P1：5-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3 P2：5-ACACTCCCCATCCTCCCTGCT-3 ③ CD14（-1359）P1：5-GGCTCTGAGGAATGGGTTAC-3 P2：5-CCTCTACATGGCCCTGTCTAC-3 ④ CD14（1344） P1：5-GGCTCTGAGGAATGGGTTAC-3 P2：5-CTACATGGCCCTGTCTTCGTTAC-3 3.实验方法 * * CD14的基因与脑卒中分子机理的研究 5 号 染 色 体 外显子 内含子 启动子区域 -260C/T -1359G/T -159T/C 1344C/T 研究的技术路线 检测正常人群和脑卒中人群CD14基因型 检测正常人群和脑卒中人群CD14的血清水平 检测正常人群和脑卒中人群的血脂水平 分析CD14基因型与脑卒中、血脂水平及血清CD14水平的相关关系 选择CD14不同基因型的内皮细胞和外周血单个核细胞进行体外培养 用ELISA检测培养上清液中CD14含量 用RT-PCR测定CD14 mRNA的表达情况 通过对上述结果的综合分析，筛选出脑卒中CD14相关新危险基因，并探讨其致病机理 2 研究对象 ⑴ 正常对照组（约150例） ⑵ 脑卒中组（约150例） 模板DNA提取 PCR扩增(CD14各基因变异位点) 限制性酶切 电泳分析 3%琼脂糖凝胶电泳 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 基因型判断（PCR-RFLP的分析示意图） 138bp 194bp p1 p2 332bp Hph I Ｃ等位基因 T等位基因 332bp ＣＣ 194bp 138bp ＣT 332bp 194bp 138bp TT 332bp -260C/T -1359G/T -159T/C 1344C/T 统计学处理 四格表?2检验 R×C列联表?2检验 方差分析 ｔ检验等