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Image-Pro plus 6.0 软件应用于细胞增殖图片分析简易教程V1.2 锐博生物技术部 Image-Pro plus 软件功能强大，涵盖图像分析测量、图像处理、图像识别、图像数据库等多方面分析模 块。这里所介绍的内容仅涉及细胞增殖计数分析功能（EdU 细胞增殖分析方法），如需了解更多功能，请参考 该软件的说明书。 EdU 是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T 渗入正在复制的DNA 分子，通过基于EdU 与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA 复制活性，通过检测EdU 标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与 BrdU 检测方法相比，EdU 检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU 检测染料只有BrdU 抗体大小的 1/500， 在细胞内很容易扩散，无需DNA 变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和 组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。 EdU 细胞增殖分析方法适合绝大多数细胞系的分析，尤其适合贴壁细胞的荧光显微镜分析，只要简单的几 个步骤即可分析细胞的细胞增殖情况。 图1 EdU 检测细胞增殖分析方法 一、分析图片预览 ® 567 和 下图为使用锐博生物EDU 细胞增殖检测试剂盒所拍荧光图片，分别用555nm 激发EdU-Apollo 350nm 激发Hoechst 33342 荧光染料（为了获得更好的分析结果，建议不要将图片叠加，分开进行细胞计数为 佳）： A： B ： ® 图2 A：EdU-Apollo 567 染色；B：Hoechst 染色 二、对图像进行分析计数 A、对图2A (EdU-Apollo® 567 染色)进行分析： 1) File→ Open 选择图片所在路径；也可将图片直接拖到IPP 主窗口中进行打开; 2) 点击计数图标按钮 ，出现以下窗口： 3) 按照默认设置，点击 按钮；软件的默认设置得到了基本的细胞计数：1，2，3，8，10，11， 12，共7 个细胞。 但屏幕上却计数到 12，难道软件发生错误了吗？当然不是， 请看到Count/Size 对话框的Object 计数部分，这时我们勾选了以下两个选项： 可以看到，Total Count 为12，但In Range 为7. 这是表示共统计了 12 个，但只有7 个细胞符合要求，即实际计数为7。 4）请在上图的统计窗口[Intensity Range Selection] 区域中选择 单选按钮，进入人工调整模式。 此时[Select Colors]按钮将变为可选形式，如下图： 5）点击[Select Colors]按钮，弹出[Segmentation]对话框； 6）点击 选项卡，弹出基于直方图方式的设置选项； 7）调整左边的红线至下图位置，直方图的下方会显示选取区域128-255. 8）点击 按钮，完成方法设置； 9）随后点击 按钮，关闭对话框； 10）点击 按钮，进行重新计数。这时，计数界面也将随之改变，显示如下图： 至此，我们将看到正确的统计结果。 B、对图2B (Hoechst 染色)进行分析： 1）打开图2B，如下图: 2）点击 按钮，弹出计数对话框，选择[automatic Bright Objects]， 进行初始计数统计，统计结果如下图： 从上图看出，有些情况细胞没有全部计数，如没有统计上，细胞黏连，细胞跨界等情况。 我们要对其进行一些调整。 3）重新打开该图片，点击[Manual]单选项，再点击[Select Colors]，如下图： 4）同样选择[Histogram Based]选项卡， 5）由于本图是Hoechst 染核结果，需要选择蓝色，点击 按钮，以调整蓝色区域像素选取参数。 通过调整蓝色选取参数：20，250 （如下图）即可勾勒细胞的大小。 当点击