链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合(REMI).pdfVIP

链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合（REMI ）转化的 致病性诱变 伏建国 朱云枝 强胜** （南京农业大学杂草研究室，南京 210095 ） 摘要：以链格孢菌(Alternaria alternata (Fr.) Keissler)菌株 NEW 为供试菌株，研究了 菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响。结果表明， 制备链格孢菌原生质体比较适宜的条件为 PD 液体培养基培养 20 h, 以 0.7mol/ L NaCl 为 稳渗剂,1 %Lysing Enzyme 、1 %Drislase 和 1 %Snailase 3 种酶溶液混合使用, 30℃酶 解 3 h。对原生质体进行了限制性内切酶介导整合（REMI）转化，筛选到了链格孢菌弱致病 突变株 NEW001，为致病相关基因的标记和克隆打下了基础。 关键词：链格孢菌，原生质体，限制性酶介导整合，致病性变异 紫茎泽兰是一种世界恶性杂草，目前已对农业、环境及人类的健康造成了极大的危害(强 胜，1998)。强胜等（1998；1999；2002）在紫茎泽兰叶片的天然病株上分离到链格孢菌 (Alternaria alternata (Fr.) Keissler)，发现该菌对紫茎泽兰具有很好的防效，其产生 的一种致病毒素能够代替病原菌起到防除紫茎泽兰的作用。进一步研究还发现该毒素对其它 农田主要杂草有较高的生物活性（万佐玺等，2001），在 100ppm 浓度以下就可以杀死稗、 马唐和鳢肠等（安传福，2003）。超微结构研究发现，该毒素对叶绿体造成伤害（常缨等， 2003）。致病机理研究表明，该毒素作用于光合系统Ⅱ质体醌，引起光合作用代谢受阻（戴 新宾等，2003）。是具有开发成生物源化学除草剂潜力的。为了探索该毒素的代谢过程以及 通过改良菌株，更好地开发和利用这一具有潜力的生防菌，对致病和产毒相关基因的研究很 有必要。目前克隆基因的方法很多，其中限制性内切酶介导整合（REMI）转化在丝状真菌应 用较为广泛，操作也相对简单，目前已在包括链格孢菌等几种丝状真菌致病相关基因的研究 中应用并获得成功（Tanaka et al.,1999 ；王政逸等，2001）。但是，直接引用他们的方法 并不能获得对紫茎泽兰链格孢菌的诱变转化。在 REMI 的操作过程中，大量原生质体的获得 是前提和关键。由于不同真菌，以及不同菌株在细胞壁组成及其它一些生物学特性方面都存 在差异，制备原生质体的方法也不同，故开展研究非常必要。本文主要探索出了适合这种对 *基金项目：国家 863 项目(2001AA246012) ；国家自然科学基金资助 **通讯作者：强胜Tel: 025；E-mail: wrl@njau.edu.cn 紫茎泽兰具有特殊防效的链格孢菌(Alternaria alternata (Fr.) Keissler)原生质体制备 的方法，并通过 REMI 转化筛选到致病和产毒减弱的突变体，向致病相关基因的克隆迈出了 坚实的一步。 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒:链格孢菌菌株 NEW 是本实验室保存菌株，质粒 pSH75 由 Takashi Tsuge 赠 送(Tanaka et al 1999)。 1.2培养基:ＰＤ培养基:马铃薯 200ｇ,蔗糖 20ｇ,加水定容至 1Ｌ；PDA：马铃薯200ｇ, 蔗 糖 20ｇ,琼脂粉 15 g,加水定容至 1Ｌ；再生培养基：0.1%酵母粉，0.1%蛋白胨，1M 蔗 糖，0.8% 的琼脂； 1.3 试剂 酶制剂：蜗牛酶(Snailase,简称 S)(北京百泰生化技术公司),崩溃酶(Drislase 简称 D)(Sigma 公司),裂解酶 （Lysing Enzyme,简称L）(Sigma 公司),限制性内切酶 Hind Ⅲ(上海生工) 稳渗剂:0.7 M ＮａＣｌ、ＫＣｌ、山梨醇、蔗糖，及OM（1.2 M MgSO , 10 mM NaHPO ,pH 4 2 4 5.8），STC(1 M sorbitol,50 mM CaCl2, 50 mM Tris-Cl,pH8.0) 其它：40%PEG4000(用STC 配制)，潮酶素 B(