昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定及遗传转化研究.pdfVIP

新疆大学硕士论文 摘 要 昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定及遗传转化研究 物种在其长期的进化jj程中，形成了一系列适应或抵御不良环境影响的生理对策。其 中—种机制就是产生抗冻蛋白(又称热滞蛋白)，它能够保护生物抵抗0℃以下的冻害。抗 冻蛋白已从多种鱼类，植物及昆虫中分蔼滑到，这种蛋白可以阻止冰晶生长或屏蔽异源冰 核，通过吸附到晶核和冰晶表面来阻止结冰，能以非依数形式降低水溶液的冰点，但对熔 点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰A2_间出现差值。这种差值称为热滞活性，它是 判断抗冻活性的重要指标。 ：{． 昆虫抗冻蛋白的研究主要在n种昆虫中展开，目前已有二十多种昆虫AFP被分离纯化。 研究发现昆虫AFP的抗冻活性比鱼类和植物的高几十到一百倍，因而研究昆虫抗冻蛋白并 利用抗冻蛋白在低温保存，器官移植手术等方面具有很好的应用前景，同时抗冻蛋白的异 源表达，有可能提高植物的抗寒性能，从而使作物在低盈胁迫环境中仍能正常生长并提高 作物的产量。 植物在自然界中生长，需要不断地与周围环境进行物质和能量的交换，外界环境对 植物的影响决定着植物能否生存及其生存的适应状况。不良环境(如低温、高温、干旱、 盐渍及有毒气体等)作用于植物，会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为 代谢和生Ij乏的可逆性抑制，严重时甚至引发不可逆伤害导致整个植株死亡。研究植物对 各种环境胁迫的耐受性及抗性，提高植物对这些胁迫的忍耐能力有着重要的现实意义。 在各种胁迫中，低猛对植物的影响尤为突出。自然环境下温度是决定植物地域分布的主 要限制因子，在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质。由于植物的抗 零}生为数量形状，受微效多基因控制，而传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用 不人。近年来，人{f]试图利用所分离到的各种动、植物基因通过基因工程对植物进行定 向分子改良。由丁昆虫抗冻蛋白热滞活性明显高于其它物种，将其抗冻基因的导入可能 更有效地提高转基因植物的抗冻性。 本研究利用实验室已克隆出的昆虫抗冻蛋白基因，先在原核表达系统。p获得表达， 新疆大学硕士论文 翻烙抗血清，并验证了功能，再将抗冻蛋白基因构建植物表达载体，利用农杆菌介导法 将昆出抗冻蛋白基因整合进烟草基囚组中，为进一步研究昆虫抗冻蛋白基因在植物中的 表达与功能提供依据。 白基因在大肠杆菌中的表达与功能。利用不同的原核表达载体，将本实验室已克隆获得 signal) 成功士哇注大肠杆菌中表达。对不同表达体系，不同基因在六撕椭中表达的特性、表达 得的抗血清进行原核表达蛋白的Westernblot检测，结果表明，准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋 白与赤翅甲Oendroides 融合际签的交叉反应，进一步证明了准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因在原核表达系统中得 抗冻蛋白对细菌有明显的保护作用，并随浓度的升高而保护作用增强。这为进一步在植 物中表达抗冻蛋白基因提供依据。 其次，根据准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFPl49和：gpa,FPl49(nosignal)和洛 氏脊漠甲(pteroca∞l_oczyi 的基因序列，设计引物分别构建植物双元表达质粒pBI 转入根癌农杆菌EBAl05内，为后续的植物转基因工作奠定了基础。 最后，利用基因工程手段将准噶尔小胸鳖甲．膨／：AFPl49基因转入烟草中。采用农杆菌介 导法转化烟草。并对农杆菌介导烟草转化的—些影响因素进行了研究。实验结果表明：选 择外植体的最佳时期为一‘个月的烟草叶片，浸染最佳条件是菡液浓度为∞嘞。G．3～0．4，浸 基囚组中，RT—PCR检涣姣明抗冻蛋白基因在转基因烟草中得到转录．为进一步研究该昆虫 抗冻蛋白基因对植物的抗寒性影响奠定基础。 1 新疆大学硕士论文 关键词：民虫抗冻蛋白；原核表达；抗冻活性；植物表达载体；烟草遗传转化 Abstract Functionalcharacterizationand transformationofinsect gene