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基因工程的基本操作程序 　　　苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 　　　让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？ 苏云金芽孢杆菌 毒蛋白 普通棉花　　抗虫棉 毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌 棉花细胞 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 在以上过程中关键步骤或难点是什么？ 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 通过运载体导入 转基因棉花含抗虫基因 转基因棉花产生相应蛋白质 转基因棉花有抗虫特性 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二： 抗虫基因与棉花DNA“缝合” 关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 主要是编码蛋白质的结构基因 获取方法： 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成 外显子 内含子 与RNA聚合酶结合位点 编码区 非编码区 非编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 编码区 原核生物基因 真核生物基因 补充: 1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因文库 基因组文库 部分基因文库(CDNA文库) 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 1、从基因文库中获取目的基因 限制酶 与运载体连接 导入 基因组文库 某种生物某个时期的mRNA cDNA 反转录 受体菌群体 与运载体连接 导入 部分基因文库 （cDNA文库） IMN 基因组文库的构建 概念： 原理： PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 。 体外DNA复制 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 条件： （1）模板DNA( 需含有目的基因 ) （2）四种脱氧核苷酸(dNTP) （3）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、通过DNA合成仪用化学方法人工合成 蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的 基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 二、基因表达载体的构建-----------核心 基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 一个切口 两个黏性末端 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标志基因 基因表达载体的组成 三、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理 1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法： 显微注射技术 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 受精卵移植 2.将目的基因导入动物细胞 3.将目的基因导入微生物细胞 常用原核生物作为受体细胞的原因： 原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等 方法: Ca2+处理 四、目的基因的检测与鉴定 检测— 鉴定—— ①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 DNA分子杂交 分子杂交（注意与上不同之处） 抗原—抗体杂交