橙色红曲菌中基pyrg标记的同源转化系统的建立.pdf

摘要 摘要 出发菌株，经紫外诱变获得尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株，经测序和基因转 化试验鉴定出UM28为pyrG缺陷株。对PEG介导的转化方法优化后建立了 以pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统，并构建了含有GFP蛋白的表达载 体pGFP-pyrG，通过基因转化试验，在红曲菌中以pyrG为筛选标记进行了 GFP-蛋白的表达。主要研究内容如下： 1．根据已报道的真菌乳清苷．5’．磷酸脱羧酶基因(pyrG)的氨基酸序列，采 用CODEHOP策略设计简并引物，从橙色红曲菌的基因组DNA中克隆得到 NRRL3357的氨基酸序列同源性最高，达到81％。该基 因与Aspergillusllavus 因能够作为筛选标记应用于红曲菌同源转化系统； 2．以橙色红曲菌AS3．4384为出发菌株，经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖 pyrG基因在核苷酸序列+220bp的位置发生了突变，进而导致氨基酸水平上 Pro—Ser的突变，造成了乳清苷。5’．磷酸脱羧酶的失活。UM28通过基因转化能 够接受含有米曲霉pyrG基因的互补质粒恢复野生表型，且回复突变率低于 10{，能够用于红曲菌同源转化系统的构建； 3．对UM28菌株的原生质体制备、再生和转化方法进行了优化，采用原 使其恢复野生表型。建立了以pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统； 选标记和GFP蛋白表达单元。通过基因转化试验，在红曲菌中以pyrG为筛选 标记进行了GFP蛋白的表达。 关键词：橙色红曲菌，pyrG基因，pyrG缺陷株，同源转化系统 III Abstract Inthis wascloned fragment fromMonascusaurantiacus paper，pyrGgene DNA with its CODEHOP genomicusingdegenerateprimersdesigned strategy．And was aPCR-based obtained methodfor fosmid completesequence by screeninglibrary． Uridine strainsfrom彪aurantiacusAS3．4384wereisolatedresistance auxotrophy by 5-FOAUV to after wasobtainedandnamed mutagenesis．Onepositivecolony UM28， it wasfurther confirmed andtransformation．Theformationof bysequencing conditionthe and of conditionofUM28strainwere protoplast regenerationprotoplast a transformation asaselection optimized，andhomologous system marker