海洋甲藻蛋白质学研究以亚历山大藻为例.pdf

摘要 摘要 亚历山大藻(Alexandrium)是一类广泛分布的海洋甲藻，不仅能合成麻痹性 shellfishtoxins，PST)，引起海洋生物和人类中毒，还是引起有害 贝毒(Paralytic 藻华(Harmfulblooms，HAB)的主要物种，已对近海生态系统、沿海养殖 algal 业、人民健康和生命财产安全构成了严重威胁。 本论文针对当前甲藻蛋白质组学研究领域存在的问题，以Alexandrium为研 究对象，引入当前蛋白质组学研究领域最新技术一荧光差异凝胶电泳技术 (2D．DIGE)，建立了甲藻蛋白质鉴定标准流程，初步构建了甲藻细胞表面蛋白 及全细胞蛋白数据库，并运用2D—DIGE技术比较研究了tamarensis复合体系蛋 白质组的差异表达和特异性肽指纹谱，定量比较了链状亚历山大藻有毒野生株和 无毒变异株蛋白质组的差异表达，探讨了甲藻PST的生物合成机制。主要内容 如下： (1)建立并完善了甲藻蛋白组学研究的2D．DIGE技术。本论文运用Cydye荧光 染料标记不同的甲藻蛋白样品，优化了荧光染料标记体系，获得了lO株亚历山 大藻高质量全细胞蛋白荧光图谱，质谱结果表明荧光标记不会干扰后续的蛋白质 鉴定，为甲藻比较蛋白质组学和定量蛋白质组学研究提供了方法支撑； (2)建立了无基因测序的甲藻蛋白质鉴定标准流程。运用基质辅助激光解析电 离飞行时间质谱(MALDI．TOF／TOFMS)结合蛋白从头测序(de朋rOVO sequencing) 和同源搜索，建立了严格的甲藻蛋白质多级鉴定方法。首先，采用MASCOT方 法鉴定目前数据库中存在同源肽段的蛋白质，其次，采用甲藻表达序列标签 (Expressedtag，EST)数据库以及BLASTX分析来检索同源蛋白，最 sequence 后，采用自动从头测序和基于同源搜算法的MS．BLAST对那些不确定 (Borderline)的蛋白进行同源性检索。运用建立的甲藻蛋白质鉴定标准流程， 在亚历山大藻中成功地鉴定到38个细胞表面蛋白及216个代表低、中、高丰度 蛋白，初步建立了甲藻细胞表面蛋白及全蛋白数据库。本文所建立的蛋白鉴定方 法为甲藻蛋白质组研究提供了强大的工具。 摘要 组的差异表达，建立了三种亚历山大藻标准2D—DIGE图谱，发现A．catenella， 量上发生了整体偏移，证明它们为三个不同的物种；在此基础上鉴定了高丰度蛋 白种间特异性肽段，它们可作为一类特异性生物标志物用于鉴定和甄别现场样品 中不同亚历山大藻种类，为今后快速鉴定和识别这三种亚历山大藻奠定了方法学 基础。 (4)运用2D-DIGE技术结合MALDI-TOF／TOFMS及生物信息学分析，定量研 究了链状亚历山大藻有毒野生株ACHK．T和无毒变异株ACHK-NT的蛋白质组 差异表达。在ACHK-NT中，共有60个蛋白表达发生明显变化，其中43个高表 达，17个低表达。鉴定的47个蛋白主要参与细胞中碳代谢、物质转运、氧化胁 迫以及毒素合成等。细胞内一些生物学过程的强化或减弱，或对PST合成形成 竞争性抑制，或因直接参与毒素合成的蛋白表达发生变化导致毒素合成的一些前 体被用于其他生物学过程，造成毒素合成途径的上游被抑制或阻断，导致毒素合 成被抑制。 关键词：海洋甲藻，亚历山大藻，麻痹性贝毒，比较蛋白质组学，荧光差异凝胶 电泳，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 lI Abstract Abstract Alexandriumisawidelyspreaddinoflagellatespeciesthroughoutmany of regions the withinthis Can shellfishtoxins species genu