短乳杆菌cctcm208054生物转化制备γ-氨基丁酸及其gad系统关键基因分析.pdf

摘要 摘 要 Y．氨基丁酸是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于自然界。1，．氨基 丁酸是哺乳动物中枢神经系统的一种主要抑制性递质，具有多种生理功能，可作 为生物活性因子应用于食品、医药和饲料工业。我国已批准Y．氨基丁酸作为新资 源食品用于食品生产加工。本论文就高产丫．氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定，丫．氨基 丁酸的检测方法，发酵工艺的建立优化，产物的分离纯化，以及关键基因分析进 行了较深入的研究，主要结果如下。 1．建立了预染纸色谱方法用于氨基酸的高通量定性分析，预染纸色谱．分光 光度法用于Y．氨基丁酸的高通量定量。预染纸色谱的操作方法为：滤纸在含茚三 酮的展开剂(正丁醇：冰乙酸：水=5：3：2，v／v／v)中展开后，直接加热显色。预 染纸色谱能将谷氨酸和1，．氨基丁酸完全分开，氨基酸斑点致密，避免了传统纸色 谱的拖尾和重叠现象。优化了影响1，一氨基丁酸与茚三酮显色的重要因素如茚三酮 浓度、显色温度、显色时间和Cu2+浓度等，使显色反应完全、生色基团稳定。优 化上述因素后，将预染纸色谱偶联分光光度法用于Y．氨基丁酸的定量，实验条件 为：准确吸取2“L样品点样，色谱纸在含1．2％茚三酮的展开剂中展开后，70℃ 显色80 mL洗脱液(75％ min，将Y．氨基丁酸．茚三酮斑点从色谱纸上剪下，置于5 min，测定洗 乙醇：0．6％CUS04．5H20=38：2，v／v)中，40℃50rpm震荡洗脱60 脱液在512nin处的光吸收值。结果表明，方法在0．50～20．00 eeL的浓度范围内 利用预染纸色谱．分光光度法和HPLC同时测定样品的GABA浓度，两种方法的 测定结果无显著性差异，表明所建立的方法可用于Y一氨基丁酸的定量。 2．从泡菜中分离到高产Y．氨基丁酸的短乳杆菌NCL912。利用纸色谱初筛、 HPLC复筛，从1000余株分离自泡菜样品的乳酸菌中筛选到23株产Y．氨基丁酸 的疑是细菌，其中菌株NCL912的产量最高(15．37 g／L)。经LC—MS测定，NCL912 转化产物的分子量与丫．氨基丁酸标准品完全一致。上述结果表明，NCL912确实 6S 能转化谷氨酸，且转化产物为1，．氨基丁酸。根据表型特征、生理生化特性和1 rDNA全序列比对，鉴定NCL912为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。该菌现保 brevis 3．设计并优化了LactobacillusCCTCCM208054产Y．氨基丁酸的发酵 摘要 培养基。用单次单因子方法筛选到影响1，．氨基丁酸合成的四个重要因子为葡萄 围。然后利用响应面方法对重要因子进行分析，确定了四个因子的最佳水平，分 别为55．25 mL／L和0．0061 g／L、1．38 g／L。在各因子的最佳水平条件 g／L、30．25 下，模型预测Y．氨基丁酸产量为36．06 5．66 g／L，验证实验中实测值为3 g／L，二 者基本一致。优化发酵培养基后，CCTCCM208054的Y．氨基丁酸产量比优化前 提高了130％。 生长和合成1，．氨基丁酸的影响。5’．磷酸吡哆醛对细胞生长和Y．氨基丁酸合成没 有影响；温度、pH和初始谷氨酸钠浓度则有重要影响，最佳水平分别为30～350C、 5．0和0．25～0．50 O．01，Tween．802mL／L，MSG0．5M，pH5．0；发酵培养基除葡萄糖为35∥L、 MSG为0．4 中320C培养约10h(彳