传染性法氏囊病毒全基因组克隆及反向遗传系统的建立.pdf

《传染性法氏囊病病毒全基因组克隆及反向遗传系统的建立》 摘 要 了强有力的技术工具。对RNA病毒进行遗传拯救或构建感染性克隆已成为分子病毒学实验 室进行病毒结构与功能深入研究的必经之路。而在国内开展这方面的研究，特别是动物RNA 病毒不多。鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害世界养禽业的严重传染性之一，本研究工作以 进行IBDV功能学研究。 组抽提方案，认为超速离心后用蛋白酶K消化病毒粒子是较好的方法。反转录合成单链 eDNA，经RNase H除去杂交链的RNA后，使用经过计算机辅助设计的、位于病毒基因组 进行了条件优化，建立了特异性强、省时省力、可重复的实验操作方案。使用T．A克隆法快 速克隆PCR产物，序列分析证实获得了3259 bp的B节段 全长(GenBank登录号分别为AF493979和AYl03464)。 在对IBDV浙江分离株双节段全基因组进行生物信息学分析时，提出了未见于已有文献 十多种不同表型毒株中高度保守，作者提出了一种VP5与病毒毒力关系的推测。 VPl 报道。(新猜测③)对这一突变进行了RNA二级结构分析和理论意义评估；分析了1BDV 该科病毒独特的翻译机制有关。 的核苷酸，下同)，A2371C，这两个点突变在A节段上产生了新的Nae I酶切位点(GCc 改变3 三个点突变产生了新的EcoR V酶切位点(G—ATA里￡)。以上突变测序证实。改变后的A节 以pCI真核表达载体为骨架，构建了几种突变或未突变的含IBDV 是一种“Head．to．tail”A节段双价重组表达载体。 下观察到被转染质粒的细胞形态学发生变化，产生了类似野生lBDV感染细胞时出现的细胞 转染组的细胞培养液中提取病毒样物质进行RT．PCR，可扩增出病毒双节段全长基因组。用 NaeI酶切A节段PCR产物，用EcoRV酶切B节段PCR产物，获得与预期被引入的遗传 标记(刚NaeI、EcoR 染。把这种被标记病毒命名为Xihu2002株。 作的理论分析，解释这可能与靠近3’．NCR的局部茎环结构稳定性下降有关。国内外首次 用反向遗传学证实了IBDV A、B节段所引入的遗传标记没有出现在目前已报道的自然界存在的野生IBDV序列上，因 反向遗传系统，直接、简易、有效，无需用到复杂的技术，可操作性强。 子机制打下必要的基础，还具备研制新一代的基因缺失疫苗和标记疫苗的潜在应用前景。 关键词 反向遗传素磊；拯轰；感染枉磊隆；传染性法氏囊嘉病毒(-I马DV)；全基日殖：A 节段： ● ， Genomicand in Complete theReverse CloningDevelopment Geneticsfor Infectious BursalDisease System Virus Abstract The ofvirusesandtheirinteractionswithhostcellsand hasbenefited study