濒危名贵药用霍石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究.pdfVIP

濒危名贵药用霍山石斛 类原球茎液体培养生产活性多糖的研究 摘要 石斛作为传统名贵中草药。其资源再生，化学成分和药理活性逐渐引起人们的关注，多 糖是石斛属植物中主要的药用活性成分之一。本文以传统的名贵珍稀药用植物～霍山石斛 为主要研究对象，在建立霍山石斛类原球茎多糖高效表达悬浮培养体系的基础上，利用生物 大分子研究的最新技术和现代分离分析手段与药理实验方法，对霍山石斛类原球茎水溶性多 糖进行了提取分离纯化，并对其主要活性多糖组分lIPS．1823的组成和一级结构进行了研 究。主要研究结果如下： (1)以霍山石斛试管苗茎段为外植体，首次诱导获得了类原球茎，并建立了类原球茎 的培养体系。其中附加NAA(7．5L‘1)和KIN(O．5 g．mol gmolL。)组合的MS培养基最利 于类原球茎的形成，诱导率达到79．9％。诱导的类原球茎经长期继代培养后，从生长、植株 再生、活性多糖合成、药理作用、单糖组成及基因组DNA多态性等方面进行品质稳定性分 析，表明诱导获得的类原球茎系在品质上是稳定的。 (2)药理学研究证明了培养的类原球茎具有野生霍山石斛同样的合成活性多糖的能力。 野生霍山石斛总多糖能显著促进小鼠脾细胞和巨噬细胞分别产生IFN-y和TNF-(I，多糖作用 原球茎总多糖中分离出和野生霍山石斛相同的5个多藉组分，并表现出同样的促进小鼠脾细 胞和巨噬细胞分别产生IFN-7和TNF-a的能力，其中以水洗脱部分HPSq含量最大。建立 的多糖活性评价方法实现了对霍山石斛类原球茎培养体系的质量监控。 (3)研究分析了霍山石斛类原球茎液体培养过程中碳、氮代谢特征，阐明霍山石斛类 原球茎生长和多糖合成与细胞内源和外源碳、氮的关系。在整个培养过程中，没有观察到显 著的细胞生长延滞期，培养30d后，生物量达到最大，多糖合成与类原球茎生长表现出了 非同步的关系。细胞培养启动后，在前3d培养基中蔗糖浓度减少了一半，同时无葡萄糖和 果糖的存在，之后随着蔗糖浓度的继续下降，培养基中逐渐检测到有葡萄糖和果糖的存在， 到第9d含量达到摄大值。相反，类原球茎内源蔗糖随培养的启动，在培养的前6d，快速 积累，之后快速被消耗：内源葡萄糖和果糖含量也同时有一定程度的增加，培养9d后逐渐 被消耗。可溶酸性蔗糖酶和碱性蔗糖酶随类原球茎培养的启动逐渐被激活，分剐在培养的第 6d和第18 d活性达到最大值。细胞壁蔗糖酶在整个培养过程中活性很低，一直处于被抑制 的状态。蔗糖合成酶在培养的第18d活性达到最高，而蔗糖磷酸合成酶与细胞壁蔗糖酶相 类似，活性一直保持很低的水平。培养基中N心+在启动培养9d后几乎消耗殆尽，而类原 球茎对N03的吸收利用才刚刚开始：胞内NH4+在培养的煎3d含量急剧上升，之后又快速 被消耗，直到培养的第12d，此时类原球茎对N03-的利用才启动。谷氨酰胺合成酶和谷氨 酸合成酶随培养的启动，活性逐渐提高，分别在培养的第12d和15d活性达到最大值。硝 酸还原酶是细胞对N03-利用涉及的第一个关键性酶，在类原球茎培养初期，活性表达受到 了一定程度的抑制作用，培养9d后，活性表达逐渐提高，到第15d活性达到最大值。结果 表明solubleacidIT、alkaline IT、SS、GS、GOGAT和NR在类原球茎生长的不同阶段调控 碳和氮代谢，最终影响类原球茎生长和多糖合成。研究结果为培养体系的优化和提高多糖合 成的提供理论指导。 (4)建立了霍山石斛类原球茎两阶段培养高水平合成活性多糖的体系。在生长阶段。 通过培养基组成的优化组合，获得适合类原球茎生长的最适碳、氮源是蔗糖和硝酸钾，浓度 L～、O．5 mmol mmol一和o．06L～。在优化的生长培养基上类原球茎培养30d生物量达到 693FW g L～，生物量增加比优化前提高了230％。在多糖合成阶段，在培养基中补加蔗糖 迅速促进多糖的合成，以在培养第30d补加50L。1的蔗糖类原球茎中多糖合成能力最高， g 在补加蔗糖继续培养6天多糖产率达22L-1，是对照的近10倍。 g