橙色红曲菌pkct gene的敲除和长同源臂置换型打靶载体的构建.pdfVIP

摘要 摘要 本文采用PCR分析方法对7种14株产桔霉素的红益菌中合成桔霉素基因 —呻l(sCT的保守性进行了研究；运用DNA重组技术构建了红曲菌pksCTgene 敲除了橙色红曲菌C膨aurantiacus)AS3．4384中的pksCTgene，并对该基因缺 失株的产毒、产色素等功能进行了分析研究。本文还对运用KecET重组系统对 快速构建长同源臂置换型打靶载体的方法进行了初步探讨，为红曲菌基因打靶 研究提供了一个快速构建长同源臂载体的途径。本文的主要研究结果如下： 物的测序结果通过NCBI进行BLAST同源性分析，结果表明，本文中选用14个 扩增产物的序列之间具有高度同源性，且分别与Genbank中紫色红曲菌中的 pksCT gene启动子和终止密码子区部分序列一致。结果显示pksCT在14株产桔 霉素红曲菌菌株中具有高度地保守性。 2、以红曲菌中合成桔霉素基因——-pksCT为靶基因，以高产桔霉素的橙色 红曲菌(M 靶基因的同源臂序列。通过酶切、连接和转化等DNA重组技术，成功地构建了 一个两端含pksCTgene同源臂序列、中间为潮霉素抗性基因的置换型打靶载体 并敲除基因组上的靶基因，并通过潮霉素B抗性筛选靶基因缺失株。 3、优化了红曲菌原生质体PEG介导和电击转化体系中原生质体的浓度以及 打靶载体质粒DNA量的条件，并利用原生质体PE0介导转化和电击转化将置 基因pksCT gene，采用潮霉素抗性筛选和基因组DNA的PCR扩增法筛选， 获得一株pksCTgene缺失株PHDS26，其桔霉素表达量比原始菌株降低了 97．2％，同时红色色索和黄色色素的表达量分别提高了49．4％和28．8％。 4、合成一对引物，分别在它们的5’端设计与pHDll6上潮霉素B抗性基 因和上pUCl8载体同源的55bp短序列；以橙色红曲菌的基因组DNA为模板， II 摘要 PCR扩增pksCTgene两端外侧同源臂E、F为线性打靶DNA，电击转化到含 靶载体pHF08。 关键词：橙色红曲菌，pksCTgene，置换型打靶载体，基因敲除，长同源臂 lII Abstraet ABSTRACT wasusedto theconservatismofcitrinin Inthis analysis research paper,PCR indifferentMonascus gene-—pksCT species。Fourteenproducing biosynthesis citrininMonascus fromsevenMonascus wereusedin spp．coming species vector wasconstructedto pHDIl6 disruptpksCT experiment．ApksCT-replacemem the wastransformedintoMaurantiacus geneby geneticengineeringtechnique．and transformationand transformation． AS3．4384 PEG byprotoplast eleetroporation werescreenedwith BresistanceandPCR T