活版印刷dna片原位合成新方法及新基材研究.pdfVIP

东南大学博士学饯论文 摘要 论文题名：活版印刷DNA芯片原位台成新方法及新基材研究 禧士研究生：汤逡瑟 导师姓名：何农跃教授 学校名称：东南大学 DNA蕊片卡搴为一嵇满遥羹DNA分析硷溯手段，在基阂表达、疾病诊颧、药 物筛选等领域具存广泛应用。目前，DNA芯片发展有甄大趋势：其一是以 Affymetrix公司为代表的向高密度基因芯片发展，争取把人类所有基因探针都固 定在一涣芯片上，蒸发袋将靖生物学豹基璐研究起劐革命健静撞翻，并商可能在 将来引发薪的革命；另一种发展是以Nanogen公司为代表的过程嶷残化趋势，妇 于在实际临床诊断及军事、司法应用中，大多数情况下并不需要高密度的DNA 芯片，蔼楚器求镬携式、灵活、速度俊帮成本低，戮此，发展这种高集成、中低 密度魄DNA芯片可以在近几年避入市炀蒡发挥社会效益。隆羞入类基因组计划 的完成以及功能基因组研究的深入，要求对大量的基因信息进行离灵敏度、高特 异瞧、定量纯静裣测。遮对DNA芯片技术掇密了携战，同对也为DNA芯片披 术的发展掇供了桃遇。 然嚣，蒸困芯片静嚣《餐还存在羞成本蠢、合成效率摄篱缺熬。锲磐，探针数 分昂贵；Affymetrix’s特有的光脱保护原位合成方法需要制作一系列特定的光掩 模，成本裹，不逶合小撼最嚣求，莠且对不鼷瓣震户霉求帮不霹戆基毽芯片必矮 重新设计光掩模。尚有待于完善，为此，我们提出了一种中、低密度DNA芯片 原位合成方法一活敝印耐法，它宪全屏弃原位合成中烦琐而昂贵的掩模制备过程 及点榉法中器贵鳇攘键修镣或掭记，恧楚应用镶笨徽逯道謦状纾维载终孝孝辩按照 预先设计的探针，排列组合成所需的～系列快速印刷母版，每一张母版对应于一 种合成单体试剂。具有操作简单、成本低、革步合成产率商等优点。 本论文的主要贡献如下： 1．本文提出了～种适合于制备活版印刷法原位合成基因芯片的片基的方法… 在O．01 活牲氨基，然鬃塞接蠲予DNA原位合成，霹褥懿一秘中、羝密度骧像合袋基 因芯片新片基。红外光谱和光电子能谱表铤结果袭明：在尼龙6膜表丽形成了 大量氨基；紫外光谱优化了水解条件：pH值为12、水解回流时问36小时、 警醇建织；该拳解貘连接到391．DNA含戏仪上，按照一定豹程序合藏5-AAC CACCAAACA CAC一3’探针，收集每一步脱除的DMT溶液，测其紫外光溅， 可计算其偶联效率大于98％。 2．使用低温等离子体处理技术，制备了第二种适合于活版印刷法原位合成基因 芯片豹片基——戮H2释K：混合气体等离子侮楚疆了聚丙浠镦孔膜，采舔扫播 电镜观察了处理前后朕的形貔变化；真空全反射红外光谱和x射线光瞧子能 谱证实在其表面接枝了大量活性氨熬；用紫外光谱定量计算得知，所接枝的氨 墓浓瘦大约为0．5p．mol／cm2。该改瞧簇可惫接孀予DNA的漂位合成，其合成 的DNA探针密度远离子功S％化玻璃片基魄探针密度，势可得到98％以上的馁 联效率。 3．本论文分别采用氢气／氮气、氨气和氧气三种不同气氛的等离子体处理了聚丙 烯片基，然后分鄹进行寡核替酸原位合成。光电子能谱(xPs)证实了在其表 垂分别接技了大曩氨鏊帮羟基。荧光妇描分季厅了在三秘方法处疆豹聚蠢燎冀纂 上合成的寡核替酸与靶序列杂交的荧光强度。结果表明：三种方法处理的聚冈 烯片基都可用予DNA原位合成，但从处理工艺和荧光分析结果来看，均以氮 气／氢气等离子体处理瓣聚秀燎片基最佳。 4．本文垮徽滚体裟嚣连羧裂39IDNA合成仪土，在}{2兵吨等离予捧瑟臻静聚鞠 氟乙烯表丽直接原位合成了四条DNA探针，通过与荧光标记的靶序列杂交眉， 得到了一个32个点阵的寡核背酸阵列。X射线光电子能谱证实了经等离子体 楚淫戆蒙嚣氟乙爝表露接棱大量活戆氮基；荧竞弱摇分析院较了在等离子处疆 的聚四氟乙烯片基上合成的四条寡核萤酸序列与靶序歹0杂交后的荧光强度，其 互补序列(s．)、锚配1、2和3个碱基的序列(s：s。S。)的荧光强度比值为117．8： V 束蠢天学簿士学垃论变 乙烯可以直接用于寡核苷酸原位合成，且具有很好的杂交特异性，有望成为一 类裹密度基因芯冀耨型冀基。 5本文研究了活版印刷法DNA芯片制备原理与工蕊流程：探讨了寡核苷酸的压 印原理、