北山羊体细胞异种克隆技术分析.pdf

摘 要 北山羊属于国家一类保护动物 由于生存环境的人为破坏已濒临灭绝 为了寻找一 种新的保护珍稀动物的方法 本实验对北山羊异种体细胞核移植进行了研究 先后对比 了山羊卵巢运输温度 成熟液中的激素比例以及成熟时间对山羊卵母细胞成熟的影响 探讨了不同激活方法对山羊卵母细胞孤雌激活的影响 并用北山羊和山羊耳部成纤维细 胞进行了建系以及核型分析和生长曲线测定 测定了不同生长状态的北山羊和山羊成纤 维细胞的细胞周期 探讨了山羊新鲜卵丘细胞和培养冷冻后解冻的颗粒细胞作为核供体 对山羊核移植效率的影响 电脉冲参数对重构胚发育的影响以及血清饥饿与完全汇合培 养的北山羊和山羊成纤维细胞对重构胚发育的影响 并对异种重构胚进行了胚胎移植 实验得出以下结论 1 山羊卵巢运输温度以20~35 为佳 成熟液中以FSH8 g/ml LH0.6IU/ml 成熟 率较高 而随着山羊卵母细胞成熟时间延长 其成熟率提高 但去核率下降 2 电激活结合化学激活可以更好的激活山羊IVM 卵母细胞 在化学激活液中添加 CB 卵裂率与对照组相比差异显著 P0.05 但囊胚率差异不显著 电激活参数以 1.2~1.6kv/cm 脉冲1~2 次为佳 7% 的EH 作用7min 也可以很好的激活山羊IVM 卵母 细胞 3 组织块培养法对于原代细胞的培养要优于酶消化法 山羊和北山羊的染色体均 为 60 条 且均为端着丝粒染色体 所建北山羊和山羊成纤维细胞系开始生长缓慢 后 期生长接触抑制 属于正常细胞 北山羊细胞较山羊细胞生长慢 群体倍增时间分别为 4.46d和2.51d. 4 新鲜山羊卵丘细胞重构胚的融合率与培养颗粒细胞组差异显著(p0.05) 但卵裂 率及桑囊胚率差异不显著 颗粒细胞作为核供体融合率和卵裂率均显著高于成纤维细 胞 但桑囊胚率差异不显著 汇合培养与饥饿培养的细胞作为核供体在融合率 卵裂率 桑囊胚率上差异均不显著 p0.05 山羊重构胚电融合时电脉冲参数以电场强度 1.2~ 1.6kv/cm 脉冲持续15 s 与20 s 脉冲两次较适合重构胚的融合 北山羊异种核 移植电融合场强以1.6kv/cm 最佳 CB 有助于异种重构胚的激活 5 体外培养第9 代北山羊成纤维细胞和第6 代山羊成纤维细胞 生长至50%~60% 70%~85%和完全汇合时细胞周期分布存在明显差异 而血清饥饿和完全汇合处理细胞 vi 细胞周期分布无显著差异 即采用异种克隆北山羊时可以用生长完全汇合的方法代替血 清饥饿处理来得到G0/G1 期细胞 6 核移植325 枚异种重构胚 融合率为33.2% 70 枚卵裂重构胚移植于14 只受体 羊 有两只妊娠(14.3%) 但都于约75d 时流产 本实验结果说明 异种核移植技术可以尝试作为珍稀动物北山羊保护的一种新方 法 关键词 北山羊 山羊 异种核移植 细胞周期 vii ABSTRACT Shi Qiao-ting (Grassland Science) Surpervised by Professor Guo Zhi-qin This paper researched in the interspecies somatic nuclear transfer of Capra ibex and goat. For this aim, we do the follow experiments: A, IVM goat oocytes treated with different concentrations of FSH and LH were compared. And we compared