抗枣疯病基因的异表达研究.pdfVIP

摘要 枣(z珐却圳，巧“蚰Mill．)是我国重要的特色果树。枣疯病对枣产业危害极其严 重。抗枣疯病品种的培育已成为至关重要的问题。本试验以高抗枣疯病品种“星光” 以及感病品种婆枣为试材，对其幼叶、幼嫩枝皮的总RNA进行了提取和纯度鉴定， 旨在为进一步进行枣分子生物学研究及筛选克隆抗枣疯病基因，揭示抗枣疯病的分 子机理奠定基础。 本研究通过田间观察及cDNA—AFLP分析，以感病婆枣为对照，研究了抗病品 种在植原体侵染之后的差异表达。获得如下结果： 改良CTAB法在幼叶、幼嫩枝皮组织中均可得到高质量的鼢怆和完整的DNA， 和糖原等四种关键物质浓度进行了调整，得到总RNA提取最佳体系为：2％cTAB， 4mol，L异硫氰酸胍，2．Omol几NaCl，100mmol／Lrrris．Hcl、DH8．O，20mm01／LEDl、A、 pH8．O，2％PVP，2％p．巯基乙醇，250¨卧11l糖原。 采用在病树上嫁接健康接穗的方式使病原菌侵染接穗，通过田间观察及利用 PcR技术和荧光显微技术检测植原体。嫁接45d后，抗、感接穗出现明显差异，在 二者中均可检测到植原体；但嫁接96d后，抗病品种中己检测不到植原体，而在感 病品种中仍存在，表明这一时期可能为病原菌诱导抗性基因表达的关键阶段，应作 为差异显示的重点时期。 建立了适合枣的反转录体系，通过置换反应获得双链cDNA的产物片段，长度 在100～2500bp之间，基本符合实验要求。 建立了一套适台于枣cDNA研究的cDNA．AFLP分析的最优化体系及反应程序。 以枣cDNA为模板，对AFLP选扩反应进行了摸索和优化试验，优化得到的AFLP bu鼠r， 选扩反应体系为：20儿的反应体系中含5此模板cDNA，2此lO×PCR 94℃预变性2miIl：接着 0．15以，H209．65皿。反应程序：第一个循环是将枣cDNA 94℃变性50s，56℃退火40s，72℃延伸1min，循环23次；最后一个循环完成后， 再72℃延伸2min。 应用36对AFLP引物对抗枣疯病基因在植原体侵染之后的样品进行筛选，得到 6对能扩增出抗枣疯病基因在植原体侵染之后的差异表达条带的AFLP引物，分别是 E．TC，M．ccT，共得到19条差异表达的条带。 关键词：枣；枣疯病；反转录；cDNA-AFLP技术 Differential ofResistanceGeⅡefor WitchesBroom Exp件ssion Jujube M曲ter Jian-chao pos船raduate：Li Major：Pomolo酣 superviser：LiuMeng七un(profesgor) Abstract Chinese and fmttreeinc11iIla． jujube(z拓扛砌“s，巧“妇MilL)isimport锄tspec施c t}le to chiⅡese Jujube诮tchesbroom(，wB)endangersjujube(Z拓驴厅船，咖曲口Mill．) itissevere．Theresistant hasbecometo toclosethe induS仃y趾d species go important eXcellentcultivar resistancetoJWBand probkm．An