板栗aflp银技术体系建立及遗传多样性研究.pdfVIP

摘要 MiLer)植物，在我国南北皆有分布， 板栗为壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea 是我国的特色果树。板栗是原产我国的重要干果之一，种质资源非常丰富。但由于 长期实生繁殖，品种命名标准不一，造成品种资源底码不清，同名异物 或同物异名现象严重，给板栗资源研究、保存、评价、利用及新种质的 创新等带来很大困难。尽管前人利用分子标记对板栗也进行了一些研 断长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术，具有丰富的多态性、较 好的稳定性和较高的个体特异性，广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分 析、遗传图谱构建、基因定位等方面。本试验在建立较稳定的板栗AFLP 银染技术体系基础上，筛选出22对谱带清晰、多态性好的引物组合， 构建了47份板栗材料的指纹图谱，分析了其遗传多样性，以期为板栗 品种鉴定、亲缘关系分析、高密度遗传图谱构建、核心种质构建等奠定 基础。 主要研究结果如下： 1．针对板栗叶片组织中酚类物质、多糖、蛋白质等含量较高的特点， 采用改良的CTAB法，并添加不同的抗酚类氧化褐变物质，筛选出适宜 取液中加入2％CTAB，3％PVP一40，1％B一巯基乙醇，20mmol／LNa2S205等 物质，所提取板栗DNA纯度高、基本无降解，适于AFLP分析要求。 2．通过对板栗AFLP银染技术体系进行系统研究，建立了适于板栗 Buffer EcoRI和MseI各3U、MseI 以去除内切酶活性。变性后的酶切产物加入5pL连接液，并在PCR仪 上37℃保温12h。其中连接液包括：MseI 1．0BL，EcoRI ligase(3U·uL“)0．7pL，T4Buffer0．5pL，ddH20O．29L。连接完成后，将 之后，连接产物稀释lO倍进行预扩增。预扩产物稀释lO倍进行选扩。 选扩完成后，加入10 Loading pL 却，置于一20℃保存备用。取8pL变性的选扩产物在6％的聚丙烯酰胺凝 胶上进行电泳。电泳完成后，进行银染程序：固定、冲洗、染色、冲洗、 显影、固定、冲洗、室温干燥等。 进行选择性扩增，从中筛选出多态性较好、电泳谱带较为清晰的22对 引物组合对47份材料进行AFLP分析。 4．利用筛选出的22对引物组合，共扩增出1959条带，其中多态性 材料的DNA指纹数据库。采用二岐分类法确定样品在AFLP指纹图谱中 的差异带，根据各自差异带可以将供试样品～一区分开，并且部分品种 (品系)具有自己的特征带，可作为该材料基因型鉴定的依据。 5．采用离差平方和方法计算样品间的遗传距离。利用此遗传距离 分为两个大的类群。聚类结果表明，供试材料间遗传背景复杂，且聚类 结果与材料的地理来源没有明显的联系。 关键词： AFLP银染技术体系；指纹图谱；遗传多样性；板栗。 TheEstablishmentofAFLP Studies and on Silver-stainingAnalysisSystem Genetic in Chestnut Diversity Major．Pomology Master：．FAN Li-jing Supervisor：WANGWen-jiang Abstract fragmentlength anewDNAmolecularmarker AFLP(amplified polymorphism)is with and h