结球甘蓝抗病基克隆和分离的研究.pdfVIP

中文 摘 要 栽培面积己达几十万公顷，但结球甘蓝病害相当严重， 乙结球日蓝是我、的一沐丁!重要蔬菜， 常给厂人菜农造成极大经济损失。在我国，有关结球甘蓝的抗病育种研究取得了很大的进展， 己选育出不少抗性材料和抗性较强的品种，在现有的抗病材料中，有些材料往往伴随着经济性 状不良而难应用,P]产，且用常规的方法难以打破它们的连锁关系 传统的防治病害的方法仅 在 一定范围内有效，角J{」都有其局限性，如种子消毒，用化学农药防治既费时费工，又造成环 境污染。 随着现代月物枝术的小断发展，分子生物学研究的不断深入，利川柏物I,囚}_程手段来辅 助植物抗病台种!}小{，‘{1)\潜力，把外洲抗r#基因导入到农作物品种中，增强其对病害的抗性 成为可能，从。」!;:、、，、人力、{速。物抗病育、中、程，，、辟了植物抗病;、因:}、I(llhi。寸、、)一建立- 个比较完整的cDN八文’仁 是月展分子生物学研究的基础工作，是分离特定基因，特别是分离 高等真核生物基因的有效手段，目的基因的克隆对于研究基因结构，调节机制等方面有十分重 要意义。结球甘蓝竹为我国一种重要的蔬菜作物，其分子生物学研究方面远滞后于一些大田作 物，为了分离纪球{111*i的 些有用基因，本研究构建了结球甘蓝的cDNA文库，并对该文库的 部分特性进行了研/Lo 一到日前为山 已有些通过分离克隆植物抗病基因，把抗病基因导入到杭性弱的作物中， 以增强其抗f的报逆很多，已在玉米，番茄，亚麻，拟南芥，水稻，甜菜，小麦等作物中，成 功克隆出许多抗病基囚，这些抗病基因表现出对病毒，细菌，真菌或线虫告A-rt。克隆这些基因 主要采用图位克隆法和转座子标签法，这两种方法均需投入大量的人力，物力，耗时，而利用 同源序列法分离抗病基因显示出经济，快速的优点，根据抗病基因保守序列设计简并引物，然 后用PCR法从抗病材料的基因组或cDNA中扩增出应用于分离抗病基因的探钊，对用含抗病 基因的材料构建的D·N、文)进‘、:筛选，进而克隆出抗病基因步在本实验!}」，1F是、。用同源)字 列法，对构建的含抗病基因的cDNA文库进行筛选，分离出一个候选抗病基因，并对其序列以 及其编码的氦基酸1j 列 蛋自质特性和结构预测方面进行了分析研究，IdIII]对该基因亦进行了 芥菜的遗传转化的刊 R‘il.(获得了以下结果: 1.构建结球甘蓝cDNA文库 按SMARTNAD:( kh;沟建试剂盒说明进行操作，文库的宿主菌为大肠+IAX.I1-BLue，对文 库的部分特川研究结果为:扩增后，文库滴度为9X10pfu/ml，插入片段人小均八_500bp以_匕 以Ikb的片段’!人多数，文库重组体的重祖率为95%，并对该文库进行了扩增 保存。该文库 的指标均达到普通文库所需的要求，能够利用该文库进行结球甘蓝目的基因的分离和克隆。 2.结球甘蓝抗病基因片段的分离 参照烟草的抗花叶病毒基因N，拟南芥的抗丁香假单抱杆菌基因RPS2及亚麻的抗叶锈病基 因L6的保守区域设计简并引物，其中5端引物为:5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3,3端 引物为:5’-A(A/G)IGCTA(A/G)IGGIA(A/G)ICC-3o采用PCR热启动法，分别从高抗 TuMV甘蓝材料84075幼苗的。DNA第一条链及基因组中扩增出一条约5106p左右的DNA条带， 把PCR产物经纯化回收后，采用T/A克隆法，用T4连接酶连接pUCm-T载体，转化大肠杆菌Dl15 a，利用。一互补筛选重组子，进一步通过PCR及酶切验证，表明目的片段己克隆进入质粒载 体中。 3.抗病基因片段的侧定及分析 分别对RT-PCR产物及基因组DNAPCR产物克隆成功的重组子进行测序，分析，挑取两个 与己克隆的抗病基因同源性比较高的重组子作探针，命名为Borl,Bor2，二者的片段大小为 5136p，编码171个氨荃酸，二者的核昔酸一致性为71.3%,氨基酸的一致性为61.4%，它们与 拟南芥抗丁香假单抱杆菌基因RPS2同源性最高。 4.从cDNA文库筛选目的基因及目的基因序列分析 以Borl,Bor2基因片段为探针，用DIG进行标记，对cDNA文库进行筛选，获得一个阳性 克隆，命名为TuR2，对所得的阳性克隆进行测序和序列分析，结果表明该基因片段大小为7626p, 编码226个氨基酸，含有一个6816p的由起始密码子ATG和终止密码子TAA