荔枝(litci chinensis sonn.)基因枪转化系统的建立与优化研究.pdfVIP

兰苎查苎苎兰竺主主堡垄墨 一苎兰一 摘要 chinensis 本研究以从荔枝(Litchi Sonn．)“下番技”品种幼胚诱导并长期继代保持的 胚性愈伤组织(Embr)_ogemcCaIli，简称EC)为试验材料，采用基因枪法进行荔枝EC转化系 统的建立与优化研究。主要试验结果如下： ④优化了荔枝体胚发生条件，建立了荔枝EC高效再生系统。在附加5mg，L玉米素(zT) 的高糖(6％蔗糖)高琼脂(1O％)MS培养基上诱导荔枝体胚高频率(100％)形成；在附加10％ 椰子汁(cw)的高糖(6％蔗糖)的MS培养基中诱导体胚正常成熟并在无激素MS培养基中诱 导体胚萌发。 ②建立了荔枝基因转化的适宜受体系统。采用生长量测定的方法确定了继代培养 5．10d的荔枝Ec处于快速生长分裂期，适宜用作遗传转化受体；采用生长量测定结合定性 观察的方法测定了荔枝Ec对卡那霉素和潮霉素的敏感性，发现荔枝EC对卡那霉素不敏 感，而潮霉素对荔枝Ec有致死效应，且显著抑制其增殖，并确定50mg／L为筛选工作浓 度。 ③确定了采用基因枪轰击荔枝EC的最佳条件。以含有标记基因gus和潮霉素抗性基 因^口f的质粒pCAMBIOl301，采用基因枪轰击的方法转化荔枝EC，并对轰击条件进行了 mol／L的高渗 优化。结果表明，选择预培养5．10d的荔枝Ec，轰击前用附加甘露醇0．25 ul／枪，在氦气压力为1100 培养基前处理4h，质粒DNA用量为1．0u{；／枪．金粉用量为10 h， cin条件下轰击1次，并在轰击后在同一高渗培养基上后高渗处理16 Dsl、轰击距离为6 可以获得GUS瞬时表达的最佳效果。 ＼＼／ ④建立了荔枝抗性愈伤组织筛选、体胚发生、再生植株与转基因检测的技术体系√采 用附加50mg／L潮霉素的筛选培养基对轰击后的荔枝EC筛选，共获得大约80个抗性}卧胞 系，经进一步筛选和对培养条件的优化，保留了7个抗性细胞系(其中4个稳定表达GUS)， 经PCR检测，冒蚶和^∥基因已整合进荔枝基因组；以所保持的抗性细胞系为试验材料进 行体胚发生和再生植株的研究，共获得了再生植株30余株，其中20株来自稳定表达GUS 的抗性细胞系，经GUS组织化学检测为转基因植株，其余来自不表达GUS的抗性细胞系， 经检测为不表达Gus的植株。 此外，本研究还采用根癌农杆菌感染的方进行了荔枝Ec转化的初步研究，经筛选共 获得了4个抗性细胞系，最终2个得以保留并获得表达GUS的转基因植株。 本研究对转基因技术在荔枝品种改良上有重要意义，并为今后的荔枝转基因研究的发 展提出了问题。X j 关键词：荔枝；基因枪转化系统；、槐地；体细胞胚胎发生；转基因植株 ＼ Ⅱ 塑塞查垫查兰堡主丝丝查 墨墨塑兰 and viaParticle Establishment ofTransgenicSystem Optimization in chinensis Bombardment Litchi(LitchiSonn．)