茶树SCPL生信息机CsSCPL3功能的研究.pdfVIP

摘要 茶树中酯型儿茶素与非酯型儿茶素的区别仅在于C环3位上有无没食子基团。本 课题组前期研究表明，催化非酯型儿茶素没食子酰基化的酶是一种酰基转移酶，且该 酶可能属于丝氨酸羧肽酶类蛋白（SCPL）家族。为挖掘可能参与没食子酰基转移 功能的基因，本文首先利用生物信息学手段，对茶树转录组及基因组数据库中的 SCPL进行筛选、基序和进化树分析及功能预测。其次，利用RACE 技术，克隆 了茶树CsSCPL3基因全长，并利用荧光定量实时PCR 、原核表达、酵母真核表达及 农杆菌介导的烟草异源植物表达等技术，对该基因的组织特异性表达和功能进行预 测。本论文研究旨在为茶树SCPL蛋白功能鉴定奠定基础。主要研究结果如下： 1.参考拟南芥的分类方法，对来自茶树转录组及基因组测序数据库中 49 条 CsSCPLs 蛋白序列的基序和进化关系进行了分析和分类，结果表明，49 条茶树 CsSCPLs 可分3类，其中9条和8条分别属于 CladeIA 和 CladeIB 类蛋白；17条和 15条分别属于Clade Ⅱ和CladeⅢ类蛋白。与酰基转移相关的蛋白属于 CladeIA 类。 2.采用 RT-PCR 技术，克隆了茶树 CladeIA 类中的 CsSCPL3 基因的全长序列。 CsSCPL3 的全长为 1686 bp，开放阅读框长度为 1413bp，预测其分子量 54.7 KD， 等电点 5.81。 3.对 CsSCPL3 蛋白进行了生物信息学分析，结果表明 CsSCPL3 具有SC族羧肽 酶中S10家族特有的高度保守的“α/β水解酶折叠”结构；该蛋白包含了 1 个底物结 合位点、3 个催化作用保守区和多个 N-糖基化位点、及其 Ser-Asp-His 三联体催 化中心等 SCPL 家族的典型特征；预测 CsSCPL3 蛋白可能为分泌蛋白；该蛋白还 可能存在 4 种修饰方式，即 N-糖基化位点、蛋白激酶 C 磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ 磷酸化位点、以及N-端豆蔻酰化位点。 4.实时荧光定量PCR结果显示，CsSCPL3 在芽、叶、茎和根中都有表达，其中在 叶中的相对表达量明显高于茎和根；在幼嫩的芽中表达量明显高于成熟叶。 5 ．构建了 pET32a-CsSCPL3 重组质粒进行原核表达，并研究了不同诱导温度、 不同诱导时间等条件对重组蛋白表达的影响。结果表明，CsSCPL3基因的最佳诱导条 件为 37℃诱导4h ；目标蛋白条带的分子量为70 KD，与预测大小相符，表达蛋白以 包涵体形式存在。 6.构建了pYES-dest52-CsSCPL3重组质粒进行真核表达，成功实现了CsSCPL3基 因在酿酒酵母中的表达，但未检测到酶活性。 7.构建了 pCB2004-CsSCPL3 重组质粒，利用农杆菌 EHA105 侵染烟草，获得了 转基因烟草。转基因烟草中的 CsSCPL3 功能有待进一步验证。 关键词：茶树；丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL) ；基因家族分类；功能分析 I ABSTRACT Whether there is galloyl group at the C-3 postion of catechins makes a difference in gallated catechins and non-galloylated catechins in tea plant. Our previous works have shown that the enzyme catalyzed the gallate acylation of catechins was an acyltransferase which may belong to SCPL family. In order to investigate genes involved in gallic acyltransferase, we first used the bioinformatics to select SCPL in tea transcriptome and genome database, then