马铃薯青枯病抗相关基因的分离及其功能分析.pdfVIP

摘要 tuberosum 马铃薯(Solarium L)是继小麦、玉米、水稻之后的世界第四大作物，在世界的食 马铃薯晚疫病的世界性病害，目前尚没有行之有效的化学药剂防治办法，严重影响了马铃薯的生 产。培育抗病品种已成为防治马铃薯青枯病的根本手段。长期以来人们对马铃薯青枯病的研究和 探讨主要集中在病菌的病理学机制、分类学、流行病学等方面，而在马铃薯本身的抗病遗传特性、 马铃薯青枯病抗性相关基因的种类、数量及其表达调控途径等方面还不清楚。本研究旨在通过马 铃薯青枯病抗性相关基因的分离和分析，初步揭示参与青枯病抗性的基冈种类与数量，为进一步 深入开展青枯病的抗病机制研究及利用抗性资源进行抗病品种选育奠定基础。主要研究结果如 下： 1．建立了快速可靠的马铃薯抗青枯病鉴定新方法。并筛选出了13份抗或高抗青枯病和高感 青桔病的二倍体材料。采用传统方法和改进方法对马铃薯二倍体CE和ED群体、番茄抗病和感 病品系进行了青枯病抗性鉴定和评价，建立了更加简便快速、经济和可重复的病菌鉴定新方法一 茎枝菌液共培养法，该方法对于茄科作物的种质资源抗病性评价和筛选，特别是对于病菌诱导产 生抗性的抗(感)病植株的快速鉴定及其幼苗的先期快速筛选具有重要意义。同时利用该方法筛 选出了6份抗或高抗青枯病材料和7份高感青枯病材料(见表2．4)，其中6个材料(如商抗青桔 病基因型EDl3、高感青枯病基因型ED25等)已被用于亲本构建作图群体，为今后开展马铃薯 的抗病遗传研究奠定了基础。 2．建立了富集差异表达基因的SSH文库并获得了44个病菌侵染早期马铃薯抗青枯病相关基 因。以抗青枯病二倍体基因型EDl3为材料，青枯病菌小种3号P041为供试菌株，利用抑制差减杂 交(SSH)和微阵列杂交筛选技术相结合，获得了123个差异表达的非重复的早期抗病相关基因 可找ln较低同源性的序列(E-值lo．”)，s个(7％)无同源序列。这些无同源序列或具有较低同 源性的序列可能代表新基因。在123个差异表达的EST中，除22％的功能未知或已知功能而朱分类 和8％的无同源序列外，其余70％的EST分属于初级代谢、能量代谢、细胞结构、调控、蛋白合成 膨饰，加工、转运相关、抗病防御、转录相关和信号转导等生命过程。 在获得的123个差异表达EST中，至少有44个(约35．8％)参与了马铃薯的抗青枯病反应。这 些EsT对应的基因涉及到信号识别、信号转导、转录调控、过敏(HR)反应、系统获得性抗性(SAR)、 细胞自救与抗病防御等抗病反应的基本过程。这些抗病相关基因中大部分与已知基因高度同源， 预示着这些基因较为保守，在不同植物种的抗病反应中可能具有重要的作用。 3．构建了一个富集青枯病抗性相关基因的SMART eDNA文库。以青枯病菌小种3号(P041) h}1148 诱导24 术相结合构建了一个富集青枯病抗性相关基因的全长cDNA文库，为进行重要基因全长cDNA的克 96％，插入片段大小分布在400-1800 bp，平均大小为700-1000bp。 4．获得了三个基因的全长cDNA、四个基因的RACE产物及它们的诱导表达模式。利用RACE 与LD．PCR方法和cDNA文库相结合，快速获得了三个具有完整开放阅读框架基因的全长cDNA 的PcR产物，同时研究了这些基因的诱导表达。具体为： 氨基酸序列的同源性分别为89％和74％)。该基因受青枯病菌的诱导和JA的调节，均为上调。 推测StPl基因是马铃薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成员，在马铃薯的抗青枯病的反应中可能具 有重要作用。该基因已在GenBank注册，序列号为DQ822994。 StPMEI编码198个氨基酸，与烟草果胶甲脂酶抑制子基因具有较高的同源性(核苷酸和氨 基酸序列的同源性分别为85％和78％)。StPMEI基因的表达受青枯病菌侵染的抑制，可能与病 菌侵染早期促使果胶甲脂酶(PME)表现活性，加固细胞壁有关；但该基因又受JA的诱导可能 与病菌侵染后期细胞肇的扩展和新细胞壁的建立有关。该基因已在GenBank注册，序列号为 DQ822993。 的氨基酸序列具有59％的一致性。该基因受青枯病菌的诱导，也受JA的调节。但JA诱导后其上调 表达明显比青桔病菌诱导提前，且其维持高表达水平的时间也明显缩短。该基因已在C,eaBank注 册，序列号为DQ885360。