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第十章 植物原生质体培养与遗传操作 原生质体研究概况 一、植物原生质体的概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 二、植物原生质体研究进展 1880年，Hanstein首次使用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培养再生植株。 1985年，Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养获得再生植株。 1986年，Spangenberg et al.通过甘蓝型油菜单个原生质体培养获得再生植株。 据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养获得再生植株（1993），其中主要以农作物和经济作物为主。 植物原生质体分离 植物原生质体是去除细胞壁的细胞或是一个被质膜包被的“裸露细胞”（见图7.1），分离具有活力的原生质体是培养成功的关键。早期（19世纪末）植物原生质体用机械法进行分离，但易破碎，获得率低，程序繁琐，且应用材料有很大局限性，仅限于液泡化程度较高的细胞或长形细胞组织，如叶片、果实的表皮等。1960年，英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄幼苗根尖细胞得到原生质体，从而开创了用酶解法分离植物原生质体的新时期。目前用酶解法可从许多植物的任何一部分组织获得具有活力的原生质体。 图7.1 植物原生质体 产量高、质量好、活性强、能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。影响原生质体产量和质量的因素很多，主要是基因型、外植体、酶的种类与组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度以及分离与纯化方法等。 一、基因型与外植体的选择 一般而言，植物的各个器官如根、茎、叶、果实、种子、子叶、下胚轴及愈伤组织和悬浮培养细胞都可以作为分离原生质体的起始材料。但若要通过原生质体培养进行植物品种改良，十分重要的是基因型的选择与确定，应从主栽品种和将要推广品系中选择合适的基因型。其次是起始材料的选择应着重于容易获得、产量高、质量好并易分裂的原生质体。紫花苜蓿原生质体分离纯化研究表明，在同一种分离纯化方法下，不同品种叶片原生质体的产量明显不同。Algonquin的原生质体产量明显高于品种N4，说明基因型是获取原生质体产量高低的关键因素（见图7.2）。此外，外植体生理年龄对原生质体的产量也有很大影响。紫花苜蓿品种Oneida的不同苗龄叶片，在同一浓度酶液处理下原生质体的产量表现不同，3周苗龄叶片原生质体的产量要比4周苗龄叶片高（见图7.3）。 meth 3/enz A meth 2/enz A meth 1/enz A 纯化方法 图7.2 不同纯化方法对紫花苜蓿不同基因型N4和 Algonquin原生质体产量的影响 （引自Levée，et al，2003） 3周 4周 苗龄 图7.3 紫花苜蓿品种Oneida不同苗龄叶片 对原生质体产量的影响 二、 分离植物原生质体的酶 构成植物细胞壁的三个主要成分是：① 纤维素，占细胞壁成分的25%～50%；② 半纤维素，占细胞壁成分的53% 左右；③ 果胶质，占细胞壁成分的5% 左右。因此，分离植物原生质体的酶有三种，即纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。一般认为原生质体的分离，纤维素酶和果胶酶是必要的。但对有些植物材料，还要加入半纤维素酶。酶液的浓度（见图7.3和图7.4）和分离纯化方法（见图7.4）对原生质体产量有明显影响。酶液浓度较高时，处理同一品种同一外植体获得原生质体的产量较高。 图7.4 酶液浓度对紫花苜蓿品种N4叶片原生质体产量的影响 （引自Levée，et al，2003） 3. 渗透压的稳定剂 合适的渗透压是保证原生质体完整性的前提。细胞去壁后获得的原生质体只有质膜包被，所以，它的稳定性必须通过调节渗透压来维持，否则分离出的原生质体容易破碎或萎缩。常用的稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等，浓度一般为0.4～0.6 mol/L，加入酶液、洗液和培养基中。为提高原生质膜的稳定性，常加入CaCl2（50～100 mmol/L）、KH2PO4、MES（2－吗啡啉乙基磺酸）、葡聚糖、硫酸钾，从而提高原生质体的产量和活力。 4. 原生质体的游离 （1）材料的预处理 暗处理、预培养及低温处理可提高原生质体的分裂率。研究表明，对于龙胆试管苗的叶片，只有用4(C低温处理后得到的原生质体才能分裂；甘蔗必须先在黑暗条件下培养12 h，分离的原生质体才能分裂；莴苣只有在分离前于诱导愈伤组织的培养基上预培养2周，分离的原生质体才能分裂。 （2）材料的灭菌处理 除试管苗、愈伤组织、培养细胞不用灭菌外