高通量测序生物信息学分析基础知识-刘栓.pdf

基因组测序基础知识 ㈠De Novo 测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分 析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo 测序方法有三种： 1. 用 Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用 Roche GS FLX Titanium 直接完成全基因组测序； 3. 用 ABI 3730 或 Roche GS FLX Titanium 测序，搭建骨架，再用 Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用 De Novo 测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部 的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及 进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA 样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组 De Novo 测序对 DNA 样品有什么要求？ - 1 - (1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基 因组完整无降解(23 kb 以上)， OD 值在 1.8～2.0 之间；样品浓度大于 30 ng/μl；每次样品制备 需要 10 μg 样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg 。 (2) 对于植物， 样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或 单倍体。基因组完整无降解(23 kb 以上)，OD 值在 1.8～2.0 之间；样品浓度大于 30 ng/μl；样 品总量不小于 500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯 合。基因组完整无降解(23 kb 以上)，OD 值在 1.8～2.0 之间；样品浓度大于 30 ng/μl；样品总 量不小于 500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组 De Novo 组装完毕后需要构建 BAC 或 Fosmid 文库进行测序验证，用于 BAC 或 Fosmid 文库构建的样品需要保证跟 De Novo 测序样本同一来源。 2. De Novo 有几种测序方式 目前3 种测序技术 Roche 454 ，Solexa 和 ABI SOLID 均有单端测序和双端测序两种方式。在 基因组 De Novo 测序过程中，Roche 454 的单端测序读长可以达到400 bp ，经常用于基因组 骨架的组装，而Solexa 和ABI SOLID 双端测序可以用于组装scaffolds 和填补gap 。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end 和 Mate-pair)进行介绍。Single-read、 Paired-end 和 Mate-pair 主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将 DNA 样本进行片段化处理形成 200-500bp 的片段，引物序列 连接到 DNA 片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在 flow cell 上生成 DNA 簇，上机测 序单端读取序列(图 1)。 Paired-end 方法是指在构建待测 DNA 文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点， 在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互 补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图 2) 。 图 1 Single-read 文库构建方法 图2 Paired-end 文库构建方法