单级自养脱氮系统中功能菌的分子生物学鉴定及氨氧化反应关键酶基因的克隆与表达.pdf

中文摘要 摘 要 单级自养脱氮工艺是指在同一反应器内、由自养细菌完成由氨氮至氮气全部转化过 程的一类工艺，是近年来出现的一种新型脱氮工艺。该工艺具有简化工艺流程节省供气 量和动力消耗、不需外加碳源及减少工艺处理费用等优点，因此有很好的应用前景。但 由于该工艺脱氮机理的不明晰，因此影响了其在环保工业上的应用。本研究着眼于该系 统的功能菌，从氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的种群进化及氨氧化菌功能基因amoA和hao 的 原核表达入手，以期从生物学角度为该系统的脱氮机理的研究提供理论基础。 本研究对稳定运行、氨氮转化率及总氮去除率分别达到 90%及 80%左右的单级自养 脱氮系统的底部的活性污泥为研究材料，研究结果如下： (1)采用分子生物学方法提取活性污泥细菌总DNA ，利用特异引物Pla46rc/Amx820 对单级自养脱氮系统中的厌氧氨氧化菌 16S rDNA基因进行PCR 扩增，扩增产物经克隆、 测序及 BLAST 分析。研究结果表明，该单级自养脱氮系统中存在的厌氧氨氧化菌与目 前鉴定出的厌氧氨氧化菌 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 和 Candidatus Brocadia anammoxidans 的 16S rDNA 序列同源性达 99% ，进化分析证明与 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 进化上较为接近。 (2)以活性污泥为材料富集培养氨氧化菌，提取细菌总 DNA ，分别设计氨氧化菌 16S rDNA 、氨单加氧酶基因(amoA)及羟胺氧化酶基因(hao) 的特异引物，扩增产物经克隆、 测序及 BLAST 分析。研究结果表明该系统中存在的氨氧化菌的 16S rDNA、amoA 和 hao 分别与已知具有氨氧化功能的 Nitrosomonas europaea ATCC 19178 ，Uncultured bacterium clone amoA_SBR_JJY clone，Nitrosomonas sp. ENI-11 的同源性达到 99%，99%，100%。 进化分析证明该系统中存在的氨氧化菌和“Nitrosomonas sp. DYS323”、“Nitrosomonas sp. DYS317” 、“Uncultured bacterium clone amoA_SBR_JJY 61clone”、“ Uncultured bacterium clone amoA_SBR_JJY 70clone”、 Nitrosomonas sp.ENI-11hao2 进化上较为接近。上述研 究结果表明该系统中存在厌氧氨氧化菌和氨氧化菌，其中氨氧化菌属于亚硝化单胞菌 属，且在系统中存在几种同属不同种的氨氧化菌。 (3)本研究将成功克隆的氨单加氧酶基因(amoA)和羟胺氧化酶基因(hao) 的全长序 列，构建pET32a原核表达载体，得到重组质粒后，转化到表达宿主菌BL21(DE3) 中进行 原核表达。研究结果表明以1.0 mmol/L IPTG诱导6 h的目标融合蛋白的表达量最高，并 通过Western Blot鉴定了目的蛋白的正确表达。粗酶液活性测定结果表明，通过原核表达 的AMO和HAO均有较强的活性，为后续构建工程菌株打下了基础。 关键词：单级自养脱氮系统，氨氧化菌，厌氧氨氧化菌，鉴定，原核表达 I 英文摘要 ABSTRACT Single-stage autotrophic nitrogen removal process is achieved in one single reactor, where ammonia is oxidized to nitrogen by autotrophic bacteria simultaneously. It is a new nitrogen removal process and has many advantages such as less gas and power supplying, no