PCR Enzymes 的选用.pptVIP

本文欣赏结束 红藕香残玉簟秋，轻解罗裳，独上兰舟。 云中谁寄锦书来？雁字回时，月满西楼。 谢谢欣赏！！ * 宝生物工程（大连）有限公司, 116600 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. PCR Enzymes 的选用 (PCR: Polymerase Chain Reaction) PCR 法原理 Step 1：双链DNA热变 性（94℃）； Step 2：引物与模板单链DNA退火（55℃）； Step 3：DNA的聚合延 伸反应（72℃）； Step 4：扩增的双链DNA再次热变性（返回 Step 1）。 （Step 1～3 称为一个循环，如此循环往复25～30次） PCR 反应五要素 ● 模板DNA ● PCR用引物 ● PCR用DNA聚合酶 ● PCR用Buffer ● dNTP PCR 反应存在问题 1. 可信度（Fidelity）： PCR反应过程中的错配（Misincorporation）现象，给克 隆、变异导入带来麻烦。 2. PCR扩增的特异性： 非特异性扩增往往给实验带来麻烦。 3. 扩增的DNA长度： 一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。 4. 扩增的DNA量： 对有些检测、克隆实验，DNA量往往达不到要求。 5. PCR扩增困难： 当DNA富含GC或具有复杂二级结构时， PCR扩增困难。 6. PCR反应速度： 当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。 ● LA PCR 技术 ●LA PCR (Long and Accurate PCR）技术的关键是使用具有3’→5’ Exonuclease活性（Proof reading活性）的耐热性DNA聚 合酶。原理见右图。 ● Hot Start PCR 技术 ●第一步PCR反应的升温期（----部分），控制DNA聚合酶使其不发生作用。 抗体作用原理图 Taq 酶 抗Taq 酶抗体 抗原抗体结合 Taq 酶活性恢复 94℃加热，抗体失活 ● Hot Start PCR 技术 ● Real Time PCR 技术 Forward Primer Reverse Primer 荧光发光 报告基团 淬灭基团 DNA模板 DNA模板 荧光淬灭 PCR扩增时，荧光探针分解， 荧光发光 Taq Polymerase (5’→3’ Exonuclease) (TaqMan探针法) TaKaRa PCR Enzymes 种类 1.TaKaRa TaqTM TaKaRa TaqTM Hot Start Version 2.TaKaRa Ex TaqTM TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version TaKaRa Ex TaqTM R-PCR Version 3.TaKaRa LA TaqTM 4.Pyrobest TM DNA Polymerase 5.TaKaRa Z-TaqTM TaKaRa TaqTM ●特点 1. 进行1～2 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 比较经济的PCR用DNA聚合酶。 3. 适用于一般的PCR扩增或检测。 ●特点 1. 进行1～2 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 适用于一般的PCR扩增或检测。 3. 进行Hot Start法PCR扩增，增加PCR扩增的 特异性。 TaKaRa TaqTM Hot Start Version TaKaRa TaqTM 扩增例 扩 增 例 TaKaRa TaqTM Hot Start Version 1. TaKaRa Taq 2. TaKaRa Taq 3. TaKaRa Taq HS Ver. 4. TaKaRa Taq HS Ver. M. 100 bp Ladder Marker TaKaRa Ex TaqTM ●特点 1. 进行15 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 融合了LA PCR技术。 3. 保真性是TaKaRa TaqTM 的3～4倍。 4. 从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性考 虑，是一种多用型的PCR用DNA聚合酶。 5. Hot Start Version可进行Hot Start法PCR扩增，增加PCR扩增的特异性。 TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version TaKaRa Ex TaqTM 扩增例 扩 增 例 TaKaRa EX TaqTM Hot Start Version 1. TaKaRa EX Taq 2. TaKaRa EX Taq 3. TaKaRa EX Taq HS Ver. 4. TaKaRa EX