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摘要
摘要
胰岛素是治疗糖尿病，特别是胰岛素依赖型糖尿病的特效药，具有广阔的应
用前景。本课题旨在通过基因工程等方法，利用巴斯德毕赤酵母(Pichiamsto,动
为表达宿主，研究开发一种新型长效人胰岛素药物，在患者体内重建胰岛素基础
分泌，长时间稳定控制血糖，减轻由于频繁注射给患者带来的诸多不便和痛苦。
本课题以地特胰岛素(InsulindetemiO的cDNA为基础，根据毕赤酵母的偏好
密码子，优化合成了长效人胰岛素原类似物(Humanproinsulinanalogue，HPIA)的
在C端含有纯化标签。
组表达载体导入毕赤酵母菌株GSll5中，使其整合到酵母染色体上，经甲醇利
用表型筛选和遗传霉素(G418)梯度筛选，最终获得摇瓶表达量较高的高拷贝Mut+
’
ll
型重组酵母GS5(9K-HPIAl2)。
基以有机培养基BMMY为宜，诱导阶段最佳pH为6．5，最适温度28℃。每12
L
h添加甲醇至终浓度为1％，诱导120h后外源蛋白表达量达到最高。利用3．6
发酵罐进行重组毕赤酵母发酵实验，以甘油为碳源培养36h时，细胞干重达到
24．0
g／L，然后开始甲醇诱导，通过溶氧反馈抑制的甲醇流加工艺，溶氧值维持
在35％水平上下波动，120h后，细胞干重达到92．0
g／L，目的蛋白HPIA表达量
为115．1
mg／L。
实验利用金属螯合层析对GSl
15(9K．HPIAl2)所表达的目的蛋白进行纯化，
蛋白质电泳和质谱分析表明HPIA的分子量为7．89KDa与理论分子量相符。HPIA
经胰蛋白酶酶切去除C肽后，形成人胰岛素类似物。利用人胰岛素检测试剂盒
测得其生物活性为170．4-dU／mL。
关键词：人胰岛素原类似物；表达；重组毕赤酵母；流加发酵
AbsWact
Abstract
Asthe for forthe
specificdrug treatingdiabetes，especiallyIDDM(insulin
diabetes hasbroad ofthis
dependentmellitus)，insulinapplications．Thepurpose
to
researchisto amethod a insulin
develop producene、Ⅳlongacting analogueby
recombinantPichia inordertoreconstructthebasicsecretionofinsulin
pastoris for
diabetes wimless
patients injection．
tothecodonbiasofPichia eDNAofhuman
According pastor／s，the proinsulin
insulin
and basedontheeDNAof detcmir．
analogue(nPta)wa
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