紫杉醇合成酶基因克隆与转化产胶植物的研究.pdfVIP

紫杉醇合成酶基因克隆与转化产胶植物的研究 梁素钰 和丽岗 郑学勤 (中国热带农业科学院热带生物技术研究所) 热带作物生物技术国家重点实验室 海口 571101) 摘要 利用分段RT-PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出2条长约 1.4kb和 1.5kb的cDNA片段 克隆到pUCm-T载体中 序列拼接分析表明 该cDNA片段与Wildung M R等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同 同源性为98.42%具 有编码862个氨基酸的能力 为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性 并进一步制备 抗体以便于将来转基因植物的检测 构建了一个酵母表达载体 GAPA-T14为了转化植物构 建了2个具有不同启动子的植物表达载体 pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(胶乳特异 启动子取代35S启动子) 关键词 云南红豆杉 紫杉烯合成酶 植物表达载体 cDNA克隆 紫杉醇 [1] 紫杉醇(Taxol)是Wani等人 1971年首次从短叶红豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)树皮中分离到 1992年 12月FDA(美国食品医药 的具有独特抗癌作用的天然产物化合物(药品名Paclitaxel) 管理局)正式批准用于临床治疗其他抗癌药无效的晚期卵巢癌 现在市场上供应的紫杉醇主要 从红豆杉树皮(含量0.01%)中提取 难于满足市场需要 而长期砍伐红豆杉树将导致资源枯竭 [2] [3] 破坏生态平衡 因此 有限的资源和日益增长的需求量 使寻找高效扩展红豆杉资源和生 产紫杉醇的新方法成为急待解决的问题 紫杉醇是一种二萜烯类化合物 以广泛分布的牻牛 儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl pypophosphate [4] GGPP)为底物 经过多步酶促反应合成 紫杉烯合成酶(taxadiene synthase)是生物合成完整紫杉醇的第一个酶 直接以GGPP为底物[5] [6] Wildung M R等 于1996年首次从太平洋红豆杉(T. brevifolia)中克隆到全长cDNA共2700bp 其中编码区(开放阅读框架)为2586 bp本研究是以云南红豆杉(Taxusyunnanensis)为材料 采 用分段RT-PCR技术获得紫杉烯合成酶基因 利用基因工程的方法 用产胶植物的乳管系作 为生物反应器 将紫杉烯合成酶基因转入产胶植物 以植物体内的GGPP为底物来表达紫杉 醇前体 紫杉烯 有关这方面的研究在国内外尚未见报道 1材料与方法 1.1材料 云南红豆杉 扦插 生长在大棚内 转化受体菌为大肠杆菌 XL-1(本室保存)pUCm-T 载体系统试剂盒和PCR试剂盒购自上海生工生物工程公司 AMV-逆转录酶和限制性内切酶 等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司 引物根据Wildung M等发表的紫杉烯合成酶R 基 因序列设计 考虑到序列的长度与克隆载体相似 设计了2对引物 采用先分段克隆而后拼 接的方法进行基因克隆 为便于构建植物表达载体 设计时添加了适当的酶切位点 引物序 列如下 引物P1 5’-GGATCCATGGCTCAGCTCTCATTTAAT-3’ BamHI 引物P2 5’-ATCGTCCATAGCTCTTTCGT-3’ 引物P3 5’-CGCTGGTTGATAACATTGAG-3’ 引物P4 5’-CGCCCCGGGTCATACTTGAATTGGATCAAT-3’ SmaI 其中P1与P2是一对 P3与 P4是一对 委托上海生工生物工程公司合成 1.2方法 1.2.1云南红豆杉叶片总RNA的提取及鉴定 采用CTAB法与异硫氰酸胍相结合的方法提取叶片总RNA具体步骤如下 (1)材料2g DEPC水洗 液氮中碾磨成细粉末 转入 50 mL冰上预冷的无酶离心管中 (2) o o 管加入1