专题六血红蛋白的提取与分离..pptVIP

3 电泳的作用及其原理是什么？ 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。 10)观察结果： SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 9)脱色： 染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？P70 凝胶是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 实验操作 阅读课本相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、样品怎样处理？ 3、蛋白质怎样分离？ 实验操作 （一）样品处理 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 问：蛋白质提取和分离步骤？ 血液 血 浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 2个a－肽链 2个β一肽链 4个亚铁红素基团 ①血液组成 实验操作 （一）样品处理 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。 血红蛋白 2个a－肽链 2个β一肽链 4个亚铁红素基团 实验操作 （一）样品处理 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色 ②血红蛋白组成及作用 ③选材 本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。 实验操作 （一）样品处理 1、红细胞的洗涤 阅读课本内容，回答以下问题： 1、洗涤的目的？ 2、怎样洗涤？ 3、洗涤干净的标志是什么？ 1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次 3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作 （一）样品处理 1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？ 1、红细胞的洗涤 2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作 （一）样品处理 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样