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异种去细胞神经材料和异体BMSCs用于构建组织工程化神经修复神经缺损的相关实验研究 异种去细胞神经材料和异体BMSCs 用于构建组织工程化神经 修复神经缺损的相关实验研究 专业名称：外科学 博士生：杨俐敏 导 师：刘小林教授 中山大学附属第一医院骨科．显微外科医学部 摘要 目的： 1．本课题组已完成化学萃取方法制备去细胞周围神经修复材料的标准技术 流程研究，并在鼠、猴的动物模型修复神经缺损获得较好疗效，但着眼于临床应 用，同种异体材料的来源受到包括伦理学因素在内的多种因素制约，考虑开发异 种同类型材料的替代应是理想选择。在做替代材料研发之前，必须对人体材料本 身的成分结构变化和物理力学性能变化进行观察研究，以便后期的对比。 2．目前国内外尚无去细胞神经修复材料应用于临床的生物安全标准。而生 物安全的可靠性是临床应用的前提，根据相关文献和规定研究确定其生物安全标 准的检测方法和检测指标，并获国家权威机构的认可是为必要前提。故本课题组 与中国药品生物制品检定所首先共同研究制定标准，并按此标准进行人体去细胞 材料的多种生物安全性研究与检测，观察其是否达到临床应用所要求的生物安全 标准。 3．综合本研究目的叙述前2项的考虑，以人体材料作为异种材料，以家兔 为受体来进行多项生物安全性研究和检测，观察作为异种材料移植修复后受体的 异种去细胞神经材料和异体BMSCs用于构建组织工程化神经修复神经缺损的相关实验研究 生物安全性，为临床使用异种材料替代提供依据。 4．本课题组使用自体骨髓基质干细胞作为种子细胞构建的组织工程化神经 修复神经缺损，已在鼠、猴的动物模型取得较好效果，但临床如果个体化的使用 自体细胞作为种子细胞，存在诸多不便和不可操作因素。使用同种异体之细胞并 形成细胞库可能是解决的途径，而且可标准化有利于产业化。使用异体干细胞作 为种子细胞的主要障碍在于其可能存在的免疫排斥和异体细胞是否可在受体的 移植物内发挥同样或类似的对再生神经轴突生物学效能。本研究以猕猴为模型来 进行观察研究，并设计使用对陈旧性损伤修复后的神经再生观察和电生理观察来 比较。 材料与方法： l、材料： 1．1人体材料：来自于本院创伤严重、肢体毁损、截肢的残肢内的新鲜神 经干，经剥离周围结缔组织并修剪而成，用于结构成分分析者，修剪成40．50mm 节短备用，用于物理性状与力学研究者修成直径分别为1．5mm和5mm的长2cm 的节段备用。 1．2实验动物： 猕猴，体重2．5．5．0KG，雌雄各半，来自广东蓝岛生物技术有限公司I。 新西兰大白兔、小鼠、豚鼠均来自北京中国药品生物制品检定所动物中心， 数量与组别详见后述内容； 1．3猕猴同种异体去细胞神经材料和自体异体骨髓基质干细胞来自于上 述猕猴； 2、方法： 2．．1人体去细胞神经材料结构成份分析：HE；SABC免疫组化(含S．100， NF，COL．1，LN)髓鞘及其半定量分析。 2．2．生物力学研究；使用中检所提供的万能材料试验机测定去细胞神经的断 裂强度、断裂力、断裂伸长率。 2．3生物安全标准制定：以IS010993标准生物材料安全性检测方法为基准， 和中检所的老师共同选定体外细胞毒性、溶血、全身急性毒性、热源、皮肤刺激、 致敏、遗传毒性为标准方法，其正常生物安全值为指标。 II 异种去细胞神经材料和异体BMSCs用于构建组织工程化神经修复神经缺损的相关实验研究 2．4异种材料移植：以去细胞人体周围神经材料为供体，新西兰大白兔为受 体并被制成神经缺损修复模型，其自体神经移植和未去细胞的人体新鲜神经移植 修复为对照，以植入体内后不同时段(IW，2w，4w)外周血血清内lgG、IgM 的含量(ELISA法)和植入体及其周围肌肉组织的HE形态学表现(细胞浸润的 类型和程度)为指标，研究评估宿主对异种材料植入的免疫反应状态和移植物本 身的免疫原性； 2．5制备猕猴桡神经2cm缺损模型，同种异体去细胞神经材料与自体和异体 骨髓基质干细胞分