抑制人cFLIP基因表达shRNA腺病毒构建和功能验证.pdfVIP

中文摘要 I 抑制人cFLP基因表达的shRNA腺病毒的构建与功能验证 中文摘要 [目的】：构建能高效特异性抑制人原发性肝癌细胞中cFLIP基因表达的腺病毒载体； 达的情况；观察腺病毒cFLIPshRNA对细胞增殖的影响。 I方法l：1．根据人cFLIP 连入干扰载体，转染HepG2，采用RT-PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况。2．利 用上述mRNA合成单链目的片段，取互补的2条单链寡核苷酸进行连接反应，根据 筛选出得最佳干扰片段，构建腺病毒表达载体。3．将重组质粒转染HepG2细胞后， 将筛选获得的最佳cFLIPshRNA片段进行双酶切，片段回收后连接、转化，酶切鉴 定。筛选出阳性克隆，磷酸钙法转染293细胞，通过包装、扩增和纯化，获得重组 腺病毒Ad5．shcFLIP，设置对照组，并进行病毒滴度测定。MTT检测对肝癌细胞 HepG2的抑制率。 l timePCR检测cFLIP在肿瘤细胞 【结果1 1．cFLIP在肿瘤细胞中的表达：利用Real 中的表达，结果显示，cFLIP在肝癌细胞中高表达。2．重组质粒酶切及测序鉴定结 转化、质粒提取后，经限制性内切酶HindIII和SalI双酶切鉴定分析后，l％琼脂糖 凝胶电泳检测，获得阳性质粒，阳性质粒送公司测序，结果完全符合设计要求。3．细 2000脂质体转染法转染48h后，用倒置荧光 胞转染效率观察：经LipofectamineTM 显微镜观察HepG2细胞中绿色荧光蛋白报告基因的表达，以检测转染效率。荧光结 果显示48 h后进行 Western 作用，其中抑制作用最强的是shRNA2。5．腺病毒eFLIPshRNA的纯化与干扰效果 检测：经过载体构建、转染、包装、纯化获得表达cFLIPshRNA的腺病毒，获得了 特异性抑制肝癌细胞中cFLIP表达的腺病毒。6．腺病毒cFLIPshRNA对细胞增殖的 shRNA 影响：利用MTT方法，检测其对HepG2细胞增殖的影响，结果显示表达cFLIP 的腺病毒感染的HepG2细胞增殖能力较未感染cFLIPshRNA的腺病毒的HepG2细 胞明显下降。实验组与对照组具有显著的差异，且二者比较差别有统计学意义(P0． 05)。 【结论1：1．凋亡抑制蛋白cFLIP在肝癌细胞中高表达。2．利用线性化质粒与合成的 shRNA片段连接、转化、脂质体转染后成功构建能特异且高效阻断eFLIP表 shRNA能特异性干扰肝癌细胞中cFLIP蛋白的表达。 达的腺病毒。3．腺病毒cFLIP 4．腺病毒cFLIPshRNA能特异性抑制肝癌细胞的增殖，为进一步研究cFLIP基因对 其他肿瘤细胞增殖的影响及其临床应用奠定了基础。 硕士研究生。于健 (肝胆血管外科) 指导教师。孙传东 副教授 关键词：cFLIP；shRNA7腺病毒；肝癌；干扰 英文摘要 Constructionandfunctiona]identificationofadenoviralshRNA humancFLIP suppressing expression Abstract constructadenoviral the vectorfor cFLIP Objectives：To speciallyinhibiting